白藜芦醇脂质体凝胶对小鼠银屑病模型的治疗及经皮给药药代动力学研究

摘要

白藜芦醇是一种天然存在的多酚类化合物，众多研究结果表明，白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护、保肝、神经系统保护、免疫调节、抗衰老等多种药理作用。也有研究结果确切表明白藜芦醇对于多种皮肤病具有一定的预防或是治疗作用。白藜芦醇具有顺式及反式两种结构，反式结构的生物学活性强于顺式结构。白藜芦醇难溶于水，化学性质不稳定，易被氧化分解;口服后在体内迅速代谢，体内生物利用度低，制约了其广泛应用。近几年白藜芦醇的剂型研究成为研究热点，已有的关于白藜芦醇的剂型研究报道包括脂质体、纳米乳、环糊精包合物、乳脂体、纳米混悬液、微球、纳米粒、水凝胶等。
　　银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤疾病，主要组织病理特征包括:表皮内细胞角化不全或是角化过度、真皮内血管膨大扭曲、多种炎性细胞浸润。银屑病发病过程中涉及到多种细胞如:角质形成细胞、T细胞及树突细胞，其具体发病机制尚不清楚。在参与银屑病发病的众多细胞因子中，TNF-α具有很重要的作用。TNF-α能够促进角质形成细胞增殖、参与炎症反应的调节。临床治疗中，基于对抗TNF-α的生物制剂对于银屑病有很好的治疗效果。
　　最近几年来，咪喹莫特诱导的银屑病模型被越来越多地应用。该模型中涉及到的信号转导通路与多条参与人类银屑病发病的信号通路相似。有研究者发现，在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型中，与氧化应激系统有关的酶存在着异常的升高或降低。银屑病患者体内存在着脂类、蛋白质以及DNA的氧化损伤。异常的抗氧化系统以及活性氧的增高可能是银屑病发病机制中的关键因素。活性氧(ROS)可作为第二信使参与调控MAPK/AP-1、NF-kB、JAK-STAT等信号转导通路，而上述信号通路在银屑病皮损处活化增强。这些通路活化后可触发参与银屑病发病的细胞对于细胞因子产生反应，使得一些炎症因子、趋化因子表达增多，从而对细胞的增殖、分化产生影响。
　　经皮微透析技术被认为是评价药物在皮肤中吸收代谢的有效工具，该技术的组织损伤小，可在动物体进行实时、在线取样，在药物的经皮药代动力学研究方面显示极强的发展前景。
　　本课题的主要研究目的是从细胞水平探讨白藜芦醇对TNF-α诱导角质形成细胞增殖以及分泌Th1/Th2型细胞因子的影响。将白藜芦醇制成脂质体凝胶剂，以外用给药方式考察白藜芦醇对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的治疗作用及可能机制，并且对白藜芦醇脂质体凝胶经皮给药药代动力学进行研究，为该化合物的进一步开发利用提供证据。
　　本课题主要分四部分进行研究:
　　第一部分白藜芦醇对TNF-α诱导的角质形成细胞增殖以及分泌Th1/Th2型细胞因子的影响
　　首先采用MTT法考察白藜芦醇对TNF-α诱导角质形成细胞增殖的影响，结果表明白藜芦醇对于细胞的增殖有抑制作用并且确定TNF-α的最佳作用浓度。采用ELISA检测白藜芦醇对TNF-α诱导的角质形成细胞分泌Th1/Th2型细胞因子的影响，结果显示白藜芦醇对于角质形成细胞分泌IL-6及IL-8有抑制作用，对于IL-10则是有促进作用。体外细胞实验的结果表明，白藜芦醇能够抑制角质细胞过度增殖，影响Th1/Th2型细胞因子的分泌，其中对Th1型细胞因子（IL-6、IL-8）分泌有抑制作用，而对Th2型细胞因子(IL-10)分泌有促进作用。
　　第二部分白藜芦醇脂质体凝胶的制备及其体外透皮性能考察
　　首先确定白藜芦醇脂质体的制备方法，进而通过正交设计确定最佳处方，优化白藜芦醇脂质体的最佳制备工艺。本部分研究结果表明:采用薄膜分散法;大豆磷脂、胆固醇、白藜芦醇质量比为20∶4∶5;加入适量乙醇使之溶解，超声10min;40℃减压旋转蒸发除去溶剂，使得大豆磷脂在瓶壁上形成一层均匀薄膜;加入适量PBS(pH7.4)，旋转30min，放置2h使其充分水合;冰浴条件下超声30min，得到包封率较高的白藜芦醇脂质体。对制备工艺进行验证，制备的5批样品平均包封率为90.27％，其RSD为0.95％，结果表明该制备工艺条件稳定可靠。
　　将脂质体制备成脂质体凝胶，采用Franze扩散池考察白藜芦醇脂质体凝胶剂的体外透皮性能。体外释药结果表明:与白藜芦醇普通凝胶相比，白藜芦醇脂质体凝胶的累积透过量及皮肤中的蓄积量均有显著提高;白藜芦醇脂质体凝胶具有透皮吸收及缓释的效果。脂质体凝胶做为白藜芦醇透皮吸收载体更有优势。
　　第三部分白藜芦醇对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的治疗作用
　　首先考察白藜芦醇对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠耳部组织增厚及炎症反应的影响。参照临床上的PASI评分表，对炎症反应严重程度进行评估，并且结合组织切片染色，更直观地考察耳部组织表皮增生及炎症反应具体情况。结果表明咪喹莫特诱导组小鼠出现不同程度的红肿、增厚、鳞屑类似于银屑病病样皮损。而经白藜芦醇治疗后皮损症状得以明显缓解;异常的组织形态变化趋于正常，角质形成细胞增殖减缓，表皮内角化不全的细胞减少;PASI积分显著降低;炎性细胞浸润程度降低。白藜芦醇对于咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型有一定的治疗作用。
　　因为喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型与氧化应激系统有关的酶系统之间存在在一些联系，因此考察了白藜芦醇对银屑病小鼠模型皮肤组织中SOD活性以及MDA含量的影响。结果表明，经咪喹莫特诱导后，小鼠耳部皮肤组织中SOD活性降低，而MDA含量增高;经白藜芦醇治疗后，小鼠耳部皮肤组织中SOD活性及MDA含量能恢复趋于正常。表明白藜芦醇对于银屑病样小鼠皮肤组织中异常的氧化应激系统有纠正作用，这有可能是白藜芦醇发挥治疗作用的机制。
　　第四部分白藜芦醇脂质体凝胶经皮给药药代动力学研究
　　本部分的研究采用微透析(MD)技术联用高效液相色谱仪(HPLC)测定白藜芦醇经皮给药后皮肤中的浓度变化情况，对白藜芦醇经皮给药的药代动力学进行考察。白藜芦醇为脂溶性化合物，脂溶性化合物的探针回收率较低，而对于探针回收率过低的化合物微透析技术不适用。因此，首先从提高探针回收率的角度对灌流液进行优化，筛选出合适的灌流液，最终确定pH值为9的PBS作为灌流液。考察了流速对白藜芦醇的探针体内体外回收率的影响，确定了灌流速度为2μl/min。考察了浓度对白藜芦醇的探针体内体外回收率的影响，结果表明浓度对于白藜芦醇的探针体内体外回收率没有影响。对探针的体内体外回收率稳定性进行考察，结果显示在取样过程中探针的回收率基本保持一致。通过对影响探针回收率的主要因素以及探针稳定性的考察，表明微透析技术可用于白藜芦醇经皮给药后药动学研究。
　　SD大鼠局部给予(0.5g/100g)白藜芦醇脂质体凝胶或白藜芦醇普通凝胶，于不同时间点进行微透析取样，HPLC检测透析液中白藜芦醇的浓度。根据白藜芦醇的探针体内回收率推算出其在皮肤局部的实际浓度，得到白藜芦醇两种制剂经皮给药后皮肤内药时曲线。采用3P97药代动力学软件，以非房室模型分别处理白藜芦醇脂质体凝胶和普通凝胶皮肤内药物浓度-时间数据，计算出药代动力学参数。白藜芦醇脂质体凝胶的药动学参数Tmax、Cmax、T1/2、AUC0-t、MRT分别为327.2±9.4 min、91.7±3.2 ng.ml-1、453.8±10.9 min、688323.6±2274.5 ng.min.ml-1、395.3±11.6 min。白藜芦醇普通凝胶的药动学参数Tmax、Cmax、T1/2、AUC0-t、MRT分别为290.8±8.2 min、75.8±5.1 ng.ml-1、389.5±14.5 min、558455.2±3481.6 ng.min.ml-1、368.5±14.1 min。结果表明白藜芦醇脂质体凝胶在皮肤内的保留时间以及药物浓度显著高于普通凝胶剂，具有良好的缓释效果。
　　本研究从细胞水平及整体动物水平对白藜芦醇治疗银屑病的机制及疗效进行评估;首次制备了白藜芦醇脂质体凝胶，并且对其经皮给药后药代动力学进行考察，为这一化合物今后的开发利用奠定了基础。