恶性胆胰肿瘤N糖组标志物和相关机制研究

摘要

胰腺癌和胆管癌是常见的恶性消化道肿瘤，由于早期诊断率低，大多数患者就诊时已属肿瘤晚期，缺乏有效的治疗手段，存活率低，故提高胰腺癌和胆管癌早期诊断率和发现潜在的干预靶点尤其重要。
　　N-糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要手段，导致细胞表面受体、粘附分子E-钙联素和整合素等各种糖蛋白功能的变化，这些变化与癌细胞的表型息息相关。而糖基化是由不同的糖基转移酶催化产生，糖基转移酶的活性及其基因表达在癌症等疾病中发生变化。因此，分析患者的N-糖组结构及相应糖基转移酶的变化，有望找到恶性胆胰肿瘤的早期诊断标志物，并揭示糖基转移酶在胆胰恶性肿瘤发生发展中的作用。本研究对恶性胆胰肿瘤患者血清的N-糖组结构进行分析，联合现有临床肿瘤标志物，建立早期诊断模型。并对相应糖基转移酶在胆胰恶性肿瘤组织中的表达情况进行研究，进一步深入阐述糖基转移酶在体内外对胰腺癌、胆管癌细胞系生物学功能的影响和相应的机制，寻找潜在的干预靶点。
　　第一部分恶性胆胰肿瘤患者血清N-糖组分析
　　目的:识别和验证基于N-糖组分析的生物标志物，联合现有临床肿瘤标志物，提高胆胰肿瘤的早期诊断率。
　　方法:利用DSA-FACE技术分别对164例胰腺癌及对照血清（包括72例胰腺癌、26例胰腺炎和66例性别、年龄相匹配的健康对照）、171例胆管癌及对照血清（包括59例胆管癌、32例胆管结石、20例胆管囊肿和60例健康对照）的N-糖组图谱进行分析，比较各组血清之间各峰值的差异，并通过logistic回归法对差异的各峰值建立诊断模型，用ROC曲线评估诊断模型的诊断和鉴别诊断效应。
　　结果:
　　一、胰腺癌部分:(1)相对于正常对照组，胰腺癌患者，四个N糖结构(NGA2F,Peak1; NA3Fb,Peak9; NA3Fc, Peak10; NA4Fb, Peak12)升高，三个N糖结构(NG1A2F，Peak4;NA2F，Peak6;NA3，Peak8)下降。(2)建立诊断模型GlycoPCtest=(peak9+10+12/peak4)。在胰腺癌建模组中诊断模型的ROC曲线下面积为0.859，最佳截断值（cut-off值）为0.97时对应的灵敏度和特异度分别为69.44％、89.39％。验证组中GlycoPCtest的灵敏度、特异度分别为75％，82.76％。(3)联合肿瘤标志物CA19-9，建立诊断模型PCmodle=2.376GlycoPCtest+0.052CA19-9-4.075，建模组诊断的ROC曲线下面积为0.937，最佳截断值为-0.06对应的灵敏度、特异度分别为80.56％、98.48％。验证组中灵敏度和特异度分别为91.67％、89.66％。诊断模型GlycoPCtest和PCmodle的灵敏度均较CA19-9、CEA对应的灵敏度明显升高。
　　二、胆管癌部分:(1)相对于正常对照组，胆管癌患者，三个N糖结构(NA3Fb，Peak9;NA3Fc，Peak10; NA4Fb，Peak12)升高，两个N糖结构(NA2F，Peak6;NA2FB，Peak7)下降。(2)鉴别胆管癌和正常对照时，建立诊断模型Glycomodel1=10.183Peak10+3.232Peak12+0.073 CA19-9-8.381。诊断模型的ROC曲线下面积为0.977，最佳截断值（cut-off值）为0.552时对应的灵敏度和特异度分别为91.5％、98.3％。(3)区分胆管结石和胆管癌时，建立诊断模型Glycomodel2=9.442Peak10+0.009CA19-9-4.390，诊断模型的ROC曲线下面积为0.925，最佳截断值（cut-off值）为0.648对应的灵敏度、特异度分别为81.4％、93.8％。(4)区分胆管囊肿和胆管癌时，Peak10的ROC曲线下面积为0.923，最佳截断值(cut-off值)为0.485对应的灵敏度、特异度分别为71.2％、100％。
　　结论:基于N-糖链的诊断模型可作为恶性胆胰肿瘤的非创伤性早期诊断标志物，并且联合肿瘤标志物CA19-9，可进一步提高N-糖链的早期诊断效能。
　　第二部分N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅴ在恶性胆胰肿瘤中的生物学功能及其机制研究
　　目的:分析胰腺癌组织和癌旁组织中N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅴ(GNT-Ⅴ)的表达情况，并对干扰GNT-Ⅴ后胰腺癌和胆管癌细胞系的生物学功能变化和相关机制进行研究，为恶性胆胰肿瘤的干预和临床意义诠释提供依据。
　　方法:利用RT-PCR法对19对胰腺癌组织和癌旁组织中GNT-Ⅴ的基因表达情况进行分析。分别构建干扰GNT-Ⅴ和对照NC的慢病毒载体，转染胰腺癌细胞系BxPC-3、ASPC-1、PANC-1、CFPAC-1和胆管癌细胞系HCCC-9810，通过流式细胞术、细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验及裸鼠荷瘤实验，观察GNT-Ⅴ的表达对胰腺癌、胆管癌细胞的增殖、迁移、侵袭及细胞周期的影响。利用WB检测干扰GNT-Ⅴ后的细胞磷酸化蛋白表达情况。
　　结果:
　　一、胰腺癌部分:(1) RT-PCR结果显示，GNT-Ⅴ在胰腺癌组织中的表达相对于癌旁组织显著降低。(2)对敲低GNT-Ⅴ和对照NC的胰腺癌细胞的生物学功能进行比较研究，结果表明敲低GNT-Ⅴ促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。检测细胞周期发现敲低GNT-Ⅴ细胞S期显著升高。裸鼠荷瘤实验表明干扰GNT-Ⅴ后促进皮下肿瘤的生长、增殖。(3)观察敲低干扰GNT-Ⅴ和对照NC的胰腺癌细胞中的磷酸化蛋白变化，表明敲低GNT-Ⅴ后细胞中p-P38MAPK明显升高。
　　二、胆管癌部分:(1)对敲低干扰GNT-Ⅴ和对照NC的胆管癌细胞的生物学功能进行研究，结果表明敲低GNT-Ⅴ抑制胆管癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。(2)观察转染干扰GNT-Ⅴ和对照NC的胆管癌细胞中的磷酸化蛋白变化，表明干扰GNT-Ⅴ后细胞中p-SAPK/JNK明显升高。
　　结论:GNT-Ⅴ对恶性胆胰肿瘤的增殖、迁移、侵袭具有重要的生物学意义，但在胰腺癌和胆管癌中的作用不一致，并且在胰腺癌和胆管癌中分别通过不同的信号通路发挥作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分 恶性胆胰肿瘤患者血清N-糖组分析

一、胰腺癌患者血清N-糖组分析

二、胆管癌患者血清N-糖组分析

参考文献

第二部分 N-乙酰葡萄糖基转移酶V在恶性胆胰肿瘤中的生物学功能及其机制研究

一、N-乙酰葡萄糖基转移酶V在胰腺癌中的生物学功能及其机制研究

二、N-乙酰葡萄糖基转移酶V在胆管癌中的生物学功能及其机制研究

参考文献

研究工作小结

综述 胆管癌相关肿瘤标志物的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢