转染CD19-CAR的人原代T淋巴细胞的体外抗白血病作用研究

摘要

研究目的:随着基因重组技术日益进步，细胞免疫治疗被认为是新世纪肿瘤治疗中最有前景的一种治疗方式，其中嵌合抗原受体(CAR)因免除了MHC限制性等优势更被寄予厚望。本课题以MigR1质粒为表达载体，构建包括CD19单抗的单链可变区片段、CD28共刺激分子、T细胞受体-ζ链的二代靶向CD19 CAR结构(MigR1-CD19-CAR)。同时建立高表达CD19基因的CD19-K562稳定转染细胞株及其稳定成瘤NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型。进一步优化MigR1-CD19-CAR逆转录病毒对人T淋巴细胞(CAR-T)的转染效率，并以CD19-K562为靶细胞，对CAR-T细胞体外抗白血病作用进行初步研究。
　　研究方法:合成CD19单抗的单链可变区片段、CD28共刺激分子、T细胞受体-ζ链的目的基因序列。上述目的基因经电泳后行胶回收，利用酶切及连接反应将其构入MigR1质粒，转化DH5α感受态细胞，菌落挑取阳性克隆后经测序验证序列准确性。同上方法以扩增后CD19基因片段构建MigR1-CD19重组质粒并测序验证。将构建的MigR1-CD19重组质粒转入Plat-A包装细胞，收集病毒上清重复转染K562细胞系，采用流式细胞仪检测CD19基因表达情况后体外反复传代获得稳转株，并以细胞计数、AnnexinⅤ/PI双重染色法分别检测其细胞增殖与凋亡特性。应用稳转株皮下接种NOD-SCID小鼠经体内、体外传代后建立移植瘤亚系CD19-K562-a并建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型。利用RT-PCR、瑞氏染色、免疫组化等验证CD19-K562-a细胞性质。将构建的MigR1-CD19-CAR转入plat-A包装细胞，收集病毒上清离心转染经CD3/CD28磁珠及rhIL-2(重组人白介素-2)活化扩增后的人原代T淋巴细胞及K562细胞系，流式细胞仪检测转染效率，RT-PCR检测CD19-CAR目的基因转录。酶联免疫吸附法(ELISA)检测转染后CAR-T细胞与靶细胞(CD19-K562)共培养后干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量。
　　结果:
　　1.测序验证二代MigR1-CD19-CAR及MigR1-CD19重组质粒分别与目的基因序列（仅MigR1-CD19一处碱基突变，但为无义突变）一致。
　　2.应用MigR1-CD19重组载体经Plat-A包装细胞高效产毒，病毒滴度为(4.33-7.02)×107CFU/ml，离心转染法重复转染K562细胞并体外反复传代后流式细胞仪检测CD19阳性率为(99.80±0.17)％，获得稳转株，RT-PCR检测其CD19基因相对转录水平与转染空载K562、未转染K562细胞存在明显差异，而细胞增殖、凋亡未受转染及传代过程影响。
　　3.稳转株经皮下接种NOD-SCID小鼠，瘤体制成细胞悬液后体外结合体内传代后建立移植瘤亚系CD19-K562-a，其CD19阳性率为(99.78±0.04)％，且CD19基因与K562细胞原有bcr-abl(210)基因均高效转录，瑞氏染色见CD19-K562-a、CD19-K562、未转染K562细胞均呈现未分化阶段细胞形态。CD19-K562-a皮下接种NOD-SCID小鼠建立移植瘤模型后行瘤体免疫组化，证实CD19-K562-a瘤体组CD19基因表达强阳性。
　　4.MigR1-CD19-CAR重组载体转入Plat-A包装细胞后病毒滴度5.43-7.34×107CFU/ml，分离健康供者及化疗后缓解的B系血液系统肿瘤患者的外周血单个核细胞，经CD3/CD28磁珠联合rhIL-2活化扩增后，T淋巴细胞比例可高达(96.1±4.8)％。
　　5.相同转染条件（32℃、1800 r/min、离心半径18.76cm、病毒滴度一定）时，K562细胞系转染效率高于T淋巴细胞(80.05±4.35)％VS(25.1±5.77)％。对活化扩增后的人原代T淋巴细胞，上述转染条件下，离心转染120min的转染效率为(54.5±14.62)％，相较未离心组(26.6±6.15)％、离心30min组(25.1±5.77)％、离心60min组(30.8±5.54)％均明显提高，后三组无统计学差异;根据个体T淋巴细胞体外活化扩增倍数选择合适的转染时机从而提高转染效率，健康供者转染效率最高达(68.7±0.6)％，B系恶性血液系统肿瘤患者（化疗后缓解）转染效率最高达(59.8±0.5)％。
　　6.RT-PCR检测证实CD19-CAR目的基因在CAR-T细胞中高效特异性转录。针对scFv片段、跨scFv末端酶切位点至CD28片段、跨CD28末端酶切位点至TCR片段的3组引物，三组片段相对转录水平分别为(2057±549)％、(3737±1101)％、(1001±110)％，对各自阴性对照存在显著统计学差异（P值均小于0.01）。
　　7.CD19-CAR-T细胞与CD19-K562细胞共培养组IFN-γ(13229.93±1542.99)pg/ml、TNF-α(4466.72±210.77) pg/ml释放量均增加，与阴性对照组统计学差异均显著。
　　结论:
　　1.MigR1-CD19-CAR及MigR1-CD19重组载体均构建成功。
　　2.成功建立CD19阳性率高达(99.80±0.17)％的CD19-K562稳定转染细胞株。
　　3.采用体外结合体内传代建立稳定成瘤的NOD-SCID小鼠移植瘤亚系CD19-K562-a并成功建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型。
　　4.转染条件为32℃、1800 r/min、离心半径18.76cm时，通过离心转染120min及根据体外活化扩增的人原代T淋巴细胞扩增倍数选择个体转染时机，成功优化MigR1-CD19-CAR重组载体对人T淋巴细胞转染效率，RT-PCR检测验证CD19-CAR目的基因在转染后T淋巴细胞中高效特异性转录。
　　5.转染后CAR-T细胞特异性识别靶细胞引发细胞因子IFN-γ、TNF-α释放显著增加。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 MigR1-CD19-CAR与MigR1-CD19重组载体的构建

材料与方法

结果

讨论

第二部分 建立CD19-K562稳定转染细胞株及其NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型

材料与方法

结果

讨论

第三部 分MigR1-CD19-CAR重组质粒对人原代T淋巴细胞转染效率的优化及其体外抗白血病作用初步研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述

在读期间发表论文及科研工作情况

致谢