微量硅、锶、氟掺杂羟基磷灰石涂层材料的制备及其生物学性能研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 微量硅、锶、氟掺杂羟基磷灰石涂层材料的制备及表征检测 目的：通过水热法制备硅、锶、氟离子掺杂羟基磷灰石涂层材料：HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA，并对制备材料进行表征检测。 方法：以Si、Sr、F掺杂量与其天然骨组织中的含量为同一数量级。 结果：SEM观察结果示：四组材料表面颗粒为宽20-50nm，长100-200nmHA短棒状结构沿着长轴方向整齐排列。各个样品具有等级有序形貌，HA纳米棒有序组装成微米级的片状结构，Si、Sr、F离子掺杂后对形貌影响不大；四组材料表面物相检测结果示：Si、Sr和F掺杂以后，没有观察到除了HA相的以外的杂相峰，说明所得产物是纯HA相。 结论：通过水热法成功的制备了Si、Sr、F掺杂的HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA材料；Si、Sr、F的掺杂后HA的物相表征未发生变化；HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA四组材料表面形貌一致。 第二部分 微量硅、锶、氟离子掺杂羟基磷灰石涂层材料细胞毒性及抗菌性研究 目的：对HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA四组材料的生物安全性及抗菌性进行检测。 方法：选用L929细胞为实验细胞,通过抑菌试验检测四组材料对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌性。 结果：抑菌实验结果：Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA与传统HA相比明显抑制了金黄色葡糖球菌与大肠杆菌的生长，其对大肠杆菌抑菌率分别为：7.4%、21.1%、32.2%；对金黄色葡萄球菌抑菌率分别为：4.5%、7.5%、38.3%。 结论：Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA材料与传统HA相比具有同样生物安全性，符合生物材料医用标准；Si、Sr、F离子掺杂提高了HA对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌抑菌性能。 第三部分 微量硅、锶、氟掺杂羟基磷灰石涂层材料对成骨细胞粘附活性的影响 目的：研究HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA四组材料对成骨细胞粘附活性的影响。 方法：选用MG63细胞为实验用细胞。采用CCK-8方法检测MG63细胞在HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA四组材料表面培养1、6、12、24小时材料表面细胞数量；于1、6、12h终止培养，DAPI染色法定性观察MG63成骨细胞培养在四组材料表面粘附情况；12h终止培养，SEM观察MG63细胞在四组材料表面的细胞形态；于1、6、12h终止培养，采用鬼笔环肽及DAPI双染法对四组材料表面MG63细胞骨架的形态进行动态观察；MG63细胞在四组材料表面培养24h，用移液管枪头划伤细胞层，继续培养24h，采用鬼笔环肽及DAPI双染，观察细胞在不同样品表面的迁移情况。 结果：细胞在培养6小时后，Si-HA，Si+Sr-HA，Si+Sr+F-HA组表面细胞粘附数量明显高于HA组表面细胞数量（P＜0.05）；培养12小时，HA、Si-HA，Si+Sr-HA，Si+Sr+F-HA四组材料表面粘附细胞数量依次增加，四组材料表面细胞数量相互均存在统计学差异（P＜0.05）；培养24h，Si+Sr+F-HA组细胞数量高于Si+Sr-HA表面，但两组间差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组间差异均存在统计学差异（P＜0.05）；DAPI染色定性观察结果与CCK-8细胞数量定量分析的结果相似；SEM观察MG63细胞在四组材料表面培养12h形态发现：Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA与HA、Si-HA相比，细胞铺展更好、更平坦，细胞呈多角形，具有长而大的伪足；铺展面积及细胞内骨架蛋白表达Si+Sr+F-HA组＞Si+Sr-HA组＞Si-HA组＞HA组；在划伤区域Si+Sr-HA，Si+Sr+F-HA两组迁徙细胞数量明显高于HA、Si-HA两组。 结论：以Si、Sr、F在天然骨中含量为掺杂量改性的HA促进了MG63细胞在材料表面的粘附、铺展、迁移，其材料粘附活性表现为Si+Sr+F-HA＞Si+Sr-HA＞Si-HA＞HA。 第四部分 微量硅、锶、氟掺杂羟基磷灰石涂层材料对成骨细胞增殖及凋亡的影响 目的：研究HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA四组材料对成骨细胞增殖及凋亡的影响。 方法：MG63细胞在四组材料表面培养，于1、4、7、14天终止培养，通过CCK-8法检测组材料表面细胞增殖数量；于1、4、7天终止培养，通过吖啶橙染色观察MG63成骨细胞在材料表面的增殖差异；于1、4、7、14天终止培养，流式细胞仪检测MG63细胞在四组材料表面细胞周期及凋亡。 结果：在细胞培养第4天，Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA三组材料表面MG6细胞数量明显高于HA组（P＜0.05），但Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA三组间无统计学差异（P＞0.05）；在第7天时四组材料表面细胞增殖数量：Si+Sr+F-HA＞Si+Sr-HA＞Si-HA＞HA,且各组间细胞数量差异具有统计学意义（P＜0.05）；吖啶橙染色观察结果与CCK-8检测结果相似；在细胞培养第4天：G0/G1期细胞比例：Si+Sr+F-HA＜Si+Sr-HA＜Si-HA＜HA；S期，G2/M细胞比例：HA＜Si-HA＜Si+Sr-HA＜Si+Sr+F-HA。细胞培养第7天：G0/G1期细胞比例：Si+Sr+F-HASi+Sr-HA>Si-HA>HA，但Si+Sr+F-HA与Si+Sr-HA差异不明显。在第4、7天时MG63细胞凋亡率HA＜Si-HA＜Si+Sr-HA＜Si+Sr+F-HA，但Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA两组间差异无统计学意义（P＞0.05），其它各组间均存在显著性差异（P＜0.05）；第14天，HA组与Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA两组及Si-HA组与Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA两组MG63细胞凋亡率存在显著性差异（P＜0.05）。 结论：以Si、Sr、F在天然骨中含量为掺杂量改性的HA促进了MG63细胞在材料表面增殖，其材料增殖活性表现为Si+Sr+F-HA＞Si+Sr-HA＞Si-HA＞HA。Si、Sr、F的掺杂通过降低了G0／G1时相期细胞数量比例，增加S期、G2/M期细胞量比例，同时加速了MG63成骨细胞在材料表面的凋亡来实现促进MG63细胞在材料表面的增殖。 第五部分 微量硅、锶、氟掺杂羟基磷灰石涂层材料对成骨细胞成骨分化影响的研究 目的：研究HA、Si-HA、Si+Sr-HA、Si+Sr+F-HA四组材料对成骨细胞分化的影响。 方法：MG63细胞在四组材料表面培养，分别于1、4、7、14天终止培养，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；通过实时定量PCR检测MG63成骨细胞早期分化特异标志物：碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COll-Ⅰ）、Runx2及矿化特异性蛋白骨桥蛋白（OPN）、骨唾液蛋白（BSP）、骨钙蛋白（OC）基因在材料表面的表达情况。 结果：细胞终止培养的第7、14天，OC基因表达：Si+Sr+F-HA组＞Si+Sr-HA组＞Si-HA组＞HA组；第7、14天，OPN、BSP基因表达：Si+Sr+F-HA组＞Si+Sr-HA组＞Si-HA组＞HA组，四组间均存在显著差异（p＜0.05）。 结论：Si、Sr、F离子的掺杂不仅能够促进MG63成骨细胞早期成骨分化标志物ALP、Coll-Ⅰ、Runx2的表达水平，而且提高了晚期分化及矿化OC、OPN、BSP蛋白基因的表达，并且这种促进增强效应与元素掺杂种类呈正相关。 第六部分 微量硅掺杂羟基磷灰石涂层材料促进成骨细胞活性的信号传导通路研究 目的：研究Si-HA促成骨细胞活性可能的信号传导通道。 方法：以HA为对照组，Si-HA为实验组，MG63细胞接种于两组材料表面，分别于接种后的第1、4、12、24小时及第1、4、7和14天终止培养，收集细胞，采用实时定量PCR法检测整合素、粘着斑激酶(FAK)、MAPK信号通路分子ERKl/2及其下游转录因子c-jun/c-fos的mRNA表达；Wnt信号通路分子低密度脂蛋白相关蛋白(Lrp5)、Dkkl的mRNA表达。 结果：在细胞培养的第1、4、7、14天，C-fos及C-jun基因在Si-HA组的表达显著高于HA组(P＜0.05）；在MG63细胞在材料表面培养4、7、14天时，Si-HA组Lrp5基因表达明显高于HA组(P＜0.05），DKK1基因表达显著低于HA组(P＜0.05）。 结论：Si-HA材料通过上调整合素α5、β1并激活FAK，促进MG63细胞材料表面的粘附；FAK激活MAPK信号通道ERK1/2，调节促进了下游c-fos、c-jun表达，提高了MG63细胞在Si-HA表面的增殖、分化活性。并且，通过抑制经典Wnt信号通路中DKK1基因表达，上调了Lrp5基因的表达，共同促进了MG63细胞活性。

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