蛋白酶激活受体1&4激活释放液促进肌腱修复的实验研究

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 蛋白酶激活受体1&4激活释放液的制备和鉴定
　　目的:体外探索优化蛋白酶激活受体1&4的激活方案，获得稳定制备两种受体激活释放液的方法;鉴定蛋白酶激活受体1&4激活释放液中各自不同细胞/生长因子含量。
　　方法:首先优化蛋白酶激活受体1&4激活释放液的方案，寻求激活蛋白酶激活受体的最佳激活浓度，获得的蛋白酶激活受体1&4激活释放液通过VEGF和Endostatin检测是否激活成功以及激活效率。然后通过细胞/生长因子抗体芯片筛查蛋白酶激活受体1和4激活释放液中肌腱修复相关的因子含量，再选出其中差异明显的重要因子进行ELISA实验检验和确认。
　　结果:激活蛋白酶激活受体1的激活剂最适浓度为20μM，而激活蛋白酶激活受体4的激活剂最适浓度为10μM。通过VEGF和Endostatin的ELISA试剂盒检测出蛋白酶激活受体1激活释放液中的确主要富含VEGF，而蛋白酶激活受体4激活释放液主要富含Endostatin。细胞/生长因子抗体芯片筛选结果以及ELISA实验的验证结果显示蛋白酶激活受体1激活释放液中VEGF、EGF、MCP-3、IL-8、GRO-α、MMP-9含量较高，而蛋白酶激活受体4激活释放液中含有更多的Endostatin、FGF、TGF-β。
　　结论:我们成功制备出了成人蛋白酶激活受体1&4激活释放液并优化了其制备方案，并检测出了两种释放液中与肌腱相关的主要细胞/生长因子的差异。蛋白酶激活受体1激活释放液中含有较多的促进血管生成的因子、促炎因子以及促进分解代谢的因子（VEGF、EGF、MCP-3、IL-8、GRO-α、MMP-9），而蛋白酶激活受体4激活释放液中含有更多抑制血管生成和促进细胞增殖的因子(Endostatin、FGF、TGF-β)
　　第二部分 蛋白酶激活受体1&4激活释放液对成人肌腱干细胞和内皮祖细胞的不同作用效果的体外研究
　　目的:研究探索蛋白酶激活受体1&4激活释放液对肌腱修复过程的两种关键细胞（成人肌腱干细胞和内皮祖细胞）的不同作用效果，从体外实验研究探索两种释放液在肌腱修复过程中扮演的角色。
　　方法:分别从成人肌腱组织和外周血中提取鉴定成人肌腱干细胞和内皮祖细胞，通过CCK-8实验方法检验蛋白酶激活受体1&4激活释放液对两种细胞增殖和迁移的影响，然后通过qRT-PCR、Sircol、ELISA以及Western Blot等方法研究蛋白酶激活受体释放液对肌腱干细胞分化代谢和炎症状态等相关基因和蛋白的表达影响。再通过内皮祖细胞体外成血管实验研究两种释放液对内皮祖细胞成血管能力的影响。
　　结果:首先我们成功从成人肌腱组织中提取和鉴定了肌腱干细胞，体外实验结果显示:增殖实验表明蛋白酶激活受体4激活释放液比蛋白酶激活受体1激活释放液的促增殖能力更强，迁移实验表明两者对肌腱干细胞无明显促迁移作用，而蛋白和基因组学结果表明蛋白酶激活受体4激活释放液可以诱导更多的肌腱干细胞向肌腱细胞分化并活化，细胞合成代谢能力更高，能产生并合成更多的胶原蛋白;而蛋白酶激活受体1激活释放液有一定的促增殖能力但低于前者，能诱导细胞处于更高的分解代谢水平和炎症水平。我们也成功从人外周静脉血中提取并鉴定了内皮祖细胞，体外实验结果显示蛋白酶激活受体1激活释放液促进内皮祖细胞增殖的能力强于蛋白酶激活受体4激活释放液。迁移实验显示蛋白酶激活受体1激活释放液比蛋白酶激活受体4激活释放液的促迁移能力更强。体外血管形成实验结果也表明，蛋白酶激活受体1激活释放液比蛋白酶激活受体4激活释放液的促内皮祖细胞体外血管形成更强。
　　结论:对于肌腱干细胞蛋白酶激活受体4激活释放液具有更强的促增殖、促分化、促合成代谢作用，而蛋白酶激活受体1激活释放液可促进更高的分解代谢和炎症反应水平。对于内皮祖细胞，蛋白酶激活受体1激活释放液具有更佳的促增殖、促迁移以及促血管形成作用。
　　第三部分 蛋白酶激活受体1&4激活释放液促进肌腱修复的体内实验研究
　　目的:探索研究蛋白酶激活受体1&4激活释放液促进肌腱修复的体内效果。
　　方法:本部分实验我们首先按照前面的步骤制备蛋白酶激活受体1&4激活释放液，然后在新西兰大白兔右膝制造髌腱损伤模型，然后随机分为三组分别给予蛋白酶激活受体1激活释放液，蛋白酶激活受体4激活释放液和生理盐水。4周后取材进行组织学切片染色，qRT-PCR，Western Blot和生物力学实验检测蛋白酶激活受体1&4激活释放液的体内治疗效果。
　　结果:组织HE和免疫组化染色结果显示蛋白酶激活受体4激活释放液处理后修复的肌腱组织排列较为整齐且未见明显的CD31和CD68阳性染色，而蛋白酶激活受体1激活释放液处理后修复的肌腱组织排列紊乱，并且组织中可见多处CD31和CD68阳性的血管样组织。基因和蛋白组学实验结果表明蛋白酶激活受体4激活释放液可以促进更多的Col-1和Col-3表达。生物力学实验结果表明，蛋白酶激活受体4激活释放液处理后的肌腱修复组织的力学性能高于蛋白酶激活受体1激活释放液处理组以及对照组。
　　结论:蛋白酶激活受体4激活受体释放液能有效的促进肌腱组织的修复和组织结构重塑并增加肌腱组织的力学性能;而蛋白酶激活受体1激活释放液能诱导更多的血管在肌腱组织中生成，会降低肌腱组织的力学性能。