Oct4调控动脉平滑肌细胞表型转化在胸主动脉夹层形成中的作用及机制研究

摘要

目的:
　　急性胸主动脉夹层是一种年发生率十万分之六、30天院内死亡率47.4％的致死性大血管疾病。近年来，胸主动脉夹层的病因学研究日益增多，但是迄今为止其发病机制仍没有被彻底阐明。胸主动脉夹层病因学的深入了解有助于改进其治疗效果，因此关于其发病机理的研究就显得十分重要。作为主动脉中层最为重要的细胞成分以及血管壁内细胞外基质的主要来源，人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth musclecell，HASMC)的结构及功能的完整对于维持主动脉壁的正常生物力学特性尤为重要。大量研究已报道了HASMC的功能异常与多种主动脉疾病的相关性。在特定条件下，终末分化的正常HASMC会出现表型转化，导致其生物学特性出现显著改变。针对胸主动脉夹层的研究发现，由生理条件下存在的、广泛表达α-SMA、SM22α等表型标志物基因的“收缩型”HASMC向增殖能力强且表型标志物表达下调的“合成型”HASMC转化的过程是许多胸主动脉疾病的早期事件和关键病理学改变。然而，关于HASMC表型转化的确切分子机制仍然不明。
　　Oct4是由POU5fl基因编码的、POU同源域转录因子家族的一员。作为细胞自我更新和多能性的重要调节因子，Oct4广泛表达于多能性细胞之中。此外，将Oct4与其他三个转录因子共转染至原代成纤维细胞中，能够诱导其成为诱导多能干细胞，即iPS细胞。关于疾病的研究发现，Oct4可表达于肺腺癌组织，并可导致其上皮-间质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。肿瘤细胞可通过EMT过程转化成为具有更强迁移能力和干性特征的恶性癌细胞。然而，Oct4在血管疾病中的研究却鲜有报道。据我们所知，关于Oct4在HASMC表型转化及胸主动脉夹层发病过程中的作用目前尚无报道。
　　本研究旨在探究Oct4对胸主动脉夹层发病过程中HASMC表型转化的影响及机制。
　　方法:
　　1.组织标本的收集:12例升主动脉夹层组织取自Stanford A型夹层病人。6例正常升主动脉组织取自未患有血管疾病的捐献者。2.HASMC的原代培养:原代人主动脉平滑肌细胞分离自3例夹层组织和3例正常主动脉组织。小心剥离动脉的内膜和中膜后，主动脉中膜被剪成4×4毫米大小的小块，并接种于24孔板中，每孔1-2个组织块。在孔内加入300ul含有20％FBS的DMEM培养基，每周换液两次。3.免疫组织化学染色:主动脉切片脱蜡、抗原修复并抑制内源性过氧化物酶后，孵育一抗，然后孵育辣根过氧化物酶标记的二抗，最后采用DAB进行显色。4.免疫荧光染色:福尔马林固定HASMCs后，依次孵育一抗和荧光二抗。细胞核用DAPI衬染。5.小RNA干扰及转染:按照Lipofectamine2000说明书提供的方法转染siRNA至HASMCs中。6.平板划线:用200ul移液器枪头在单层细胞中央划出一条直线，分别于划痕后0小时和24小时拍照，评价细胞迁移能力。7.Western Blot和qRT-PCR分别用于检测组织和细胞中蛋白和mRNA的表达水平。8.荧光素酶报告基因:野生型和突变型KLF5启动子区序列的PCR扩增产物分别克隆至pGL3-basic载体质粒的荧光素酶基因上游，构建pGL3-Pro-WT-KLF5 and pGL3-Pro-MT-KLF5质粒。通过PCR方法克隆人类基因组DNA中的Oct4 CDS区序列，构建Oct4过表达质粒，peDNA-Oct4。采用双荧光素酶分析系统检测荧光素酶活性。启动子活性以海肾荧光素酶活性校正后的细胞裂解液荧光素酶活性表示。9.染色质免疫共沉淀(ChIP)采用EZ-ChIP染色质免疫共沉淀试剂盒，仿照试剂盒中提供的方法进行实验。10.统计学分析:数据已均数士标准差形式表示。统计学方法采用非配对t检验，并通过SPSS软件实现。p值小于0.05认为存在统计学差异。
　　结果:
　　1.Oct4在来源于TAD病人的主动脉组织和HASMCs中表达升高。
　　Western blot和qRT-PCR结果提示，与正常主动脉相比，TAD组织中Oct4的蛋白和mRNA表达均显著升高。免疫组织化学染色提示，TAD患者的主动脉中膜中Oct4表达上调，且主要定位于HASMCs的细胞核内。细胞免疫荧光学实验发现，TAD患者来源的HASMCs中Oct4荧光明显，且特异性地定位于细胞核内。相反地，正常对照组细胞中的Oct4荧光则十分微弱，且在胞浆和胞核中均有分布。本部分结果提示Oct4可能在调控HASMCs中与TAD发病相关基因的表达方面发挥重要作用。
　　2.Oct4能够诱导HASMCs的去分化表型，并且能够提高其迁移和增殖能力。
　　Oct4过表达能够引起HASMCs中α-SMA和MYH11蛋白及mRNA的表达下调。平板划线结果提示Oct4的过表达能够增强HASMCs的迁移能力。CCK8实验则发现Oct4的过表达能够促进HASMCs的增殖。我们的进一步研究发现，Oct4的干扰敲低能够组织TNF-α诱导的α-SMA和MYH11表达下调和HASMCs增殖和迁移能力的增强。
　　3.KLF5在TAD病人的主动脉组织中表达上调，且Oct4通过上调KLF5的表达引起HASMCs的表型转化。
　　与转染GFP过表达腺病毒的HASMCs相比，转染Oct4过表达腺病毒的HASMCs中Nanog，Sox2，BMP4，Etv5 and KLF5基因的mRNA水平显著上调，而TDGF1，Nodaland Sfrp1基因的mRNA水平则明显下降。Western blot结果提示TAD主动脉中KLF5蛋白的表达水平显著高于正常主动脉组织。免疫组织化学染色结果也发现，KLF5明显表达于TAD中膜内的HASMCs中，而在正常主动脉中则少有表达。染色质免疫共沉淀结果提示Oct4能够直接与KLF5启动子区结合。进一步地，我们分别构建了包含野生型KLF5启动子和模序突变型KLF5启动子的荧光素酶报告基因质粒——pGL3-Pro-WT-KLF5和pGL3-Pro-MT-KLF5。将Oct4过表达质粒分别于上述两种质粒共转染293细胞，结果发现，Oct4能够显著激活pGL3-Pro-WT-KLF5荧光素酶报告基因的转录，而Oct4结合位点突变的模序突变型质粒则无法被激活转录。上述结果提示Oct4能够与KLF5启动子区结合并激活KLF5的转录。最后，我们的拯救实验结果证实，Oct4介导的HASMCs由收缩型向合成型的转化过程是通过，至少是部分地通过，上调KLF5的表达实现的。
　　结论:
　　Oct4在胸主动脉夹层患者的主动脉组织和HASMCs中表达上调。Oct4引起的HASMCs由收缩型向合成型的表型转化过程是通过直接上调KLF5的表达实现的。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

一、研究背景及方向

二、实验总体设计

参考文献

第一部分 Oct4在TAD和正常胸主动脉组织中的表达

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 Oct4对人主动脉平滑肌细胞表型转化的功能学研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 Oct4引起人主动脉平滑肌细胞表型转化的机制研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 血管平滑肌细胞分化与表型转化的机制研究现状

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢