具有靶向、pH响应特性的硼替佐米新剂型的合成及其在骨肿瘤治疗中的应用

摘要

目的：
　　泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System，UPS)是细胞内蛋白降解的主要途径之一。蛋白酶体内存在多种调节蛋白参与细胞的生长、增殖、分化及凋亡，该系统活性过高导致的蛋白质降解损伤可促进一些包括肿瘤在内的疾病的发生。而蛋白酶体抑制剂与蛋白酶体内的酶解活性位点结合，能阻碍靶蛋白的降解，进而影响细胞原有的增殖、分化和凋亡过程。硼替佐米(Bortezomib，BTZ)作为一个强效且特异性的蛋白酶体抑制剂，通过硼酸基团与蛋白酶体活性中心的苏氨酸残基结合从而抑制肿瘤细胞的蛋白酶体，达到治疗的目的。近年来硼替佐米在多发性骨髓瘤及套细胞淋巴瘤等肿瘤的治疗中得到充分认可，然而，由于其可非特异性的结合蛋白，在肝脏中快速被清除且组织渗透和聚集能力差等特点，对于实体肿瘤的抑制作用有限，且可造成严重的毒副反应，从而明显限制了其在临床上的广泛应用。因此，近年来国内外许多学者研究以脂质体包裹的纳米凝胶、中空介孔氧化硅纳米球、PALG纳米粒等多种材料为载体构建BTZ的控释系统，在一定程度上提升了BTZ的缓释性能和生物相容性，延长了其在肿瘤局部的停留时间。但是，这些载体仍难以靶向输送BTZ达到肿瘤部位，且难以在肿瘤部位快速释放BTZ达到有效的药物浓度。这既降低了纳米载体药物投送的效率，又对体内的正常组织和器官造成毒副作用。因此，该研究课题旨在制备一种新型的纳米载体，实现硼替佐米向肿瘤部位的主动靶向输送以并在肿瘤部位实现pH响应性释放，从而显著提高硼替佐米的肿瘤抑制效应，同时降低其毒副作用。
　　方法：
　　以第5代聚酰胺-胺树形高分子(G5 PAMAM)为基础，合成cRGD序列肽和聚乙二醇(PEG)共同修饰的、连接邻苯二酚基团(Catechol)的纳米载体cRGD-PEG-PAMAM-Cat。通过载体上含有的邻苯二酚与硼酸基团反应生成硼酸酯键，从而合成cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ复合物，即硼替佐米的新剂型。进一步用透析释放法和1HNMR波谱法分析cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ复合物在不同pH条件下的体外释放，并明确细胞对载体cRGD-PEG-PAMAM-Cat的摄取情况。在体外，以MTT实验来检测cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ复合物对肿瘤细胞的杀伤作用。最后，建立乳腺癌胫骨转移的原位动物模型，进行治疗:cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ复合物组（RGD+组），PEG-PAMAM-Cat/BTZ组（RGD-组），BTZ组和磷酸盐缓冲溶液组（PBS组）。经尾静脉注射给药治疗，定期测量各组裸鼠的体重，测量肿瘤周长变化。治疗结束后，通过分析治疗前后裸鼠胫骨肿瘤的生物荧光显像，胫骨X线、Micro-CT，骨体积，骨小梁数量，肿瘤周长变化，裸鼠体重变化等数据，同时通过TUNEL染色及血常规检测等，明确硼替佐米新剂型在体内对肿瘤的抑制情况及其毒副作用的大小。
　　结果：
　　（一）具有靶向作用、pH响应的树形高分子纳米载体的合成以及BTZ新剂型的制备
　　成功合成cRGD、PEG和邻苯二酚基团修饰的G5 PAMAM载体(cRGD-PEG-PAMAM-Cat)。1H NMR光谱图显示，合成的树形高分子载体上平均连接有36个PEG、2个cRGD及30个邻苯二酚功能基团。载体cRGD-PEG-PAMAM-Cat进一步通过邻苯二酚-硼酸盐反应形成的复合物，即cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ，也即为BTZ的新剂型。该BTZ新剂型在生理条件下(pH=7.4)具有很好的稳定性。
　　（二）cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ的体外释放、细胞摄取以及对肿瘤细胞的抑制作用
　　透析释药实验及1H NVR波谱法研究显示，在pH=7.4时，cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ在12h时候的BTZ释放量小于5％;随着pH的降低，释放速度加快。在pH=6.5时，3h的BTZ释放量为30％，在pH=5.0时，3h的BTZ释放量为52％。连接cRGD-PEG-PAMAM-Cat的芘硼酸大量进入细胞内，而单纯的芘硼酸则几乎不进入细胞，提示在cRGD与整合素结合后的介导作用下，载体可进入细胞内。MTT实验显示，cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ复合物对细胞有着明显的毒性作用，且毒性作用随着cRGD-PEG-PAMAM-Cat所复合BTZ比例的增高而增强，而未连接cRGD的PEG-PAMAM-Cat/BTZ未表现出明显的毒性作用。
　　（三）乳腺癌胫骨转移裸鼠模型的治疗评估
　　各组裸鼠在治疗前后体重未见明显改变。治疗前后各组裸鼠肿瘤的相对荧光量统计表明，RGD+组的相对荧光量明显弱于PBS组及RGD-组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。尽管RGD+组与BTZ组相比无明显的统计学意义，但RGD+组荧光量较BTZ组降低一倍左右。治疗前后肿瘤最长周径(Perimeter of tumor)大小变化显示RGD组胫骨肿瘤周长较PBS组、RGD-组和BTZ组变化小，统计结果具有统计学意义(P＜0.05)。各组裸鼠胫骨X线、Micro-CT均提示，RGD+组的骨质破坏较其他各组更轻。进一步对肿瘤破坏段胫骨进行骨体积(Bone volume)等的统计，结果具有差异性（P＜0.05），充分说明RGD+组较其他各组具有明显的肿瘤抑制、保护骨质的作用。肿瘤的重量的结果也显示RGD+组肿瘤低于其他各组，差异具有统计学意义。
　　结论：
　　我们成功合成了一种具有良好生物相容性的新型树形高分子纳米材料药物载体。在cRGD辅助下，该载体不仅可实现靶向递送药物，而且可介导载体药物复合物进入细胞内。通过邻苯二酚基团与硼酸盐形成硼酸酯键的反应实现药物的结合和释放。这使得该新剂型在生理环境条件下具有较高的稳定性，但在微酸性环境条件下响应肿瘤细胞内外的微酸性环境从而有效释放药物，提高肿瘤局部的药物浓度，起到更强的肿瘤抑制效果。总之，本研究实现了药物的靶向递送及药物的pH响应性释放，为将来临床恶性肿瘤的精准治疗提供了良好的依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 合成具有靶向作用、酸刺激响应的树形高分子纳米载体以及制备硼替佐米的新剂型

一、实验材料及方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第二部分 cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ的体外药物释放、细胞摄取及其对肿瘤细胞的抑制作用

一、实验材料及方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第三部分 乳腺癌胫骨转移瘤裸鼠模型的治疗评估

一、实验材料及方法

二、结果

三、讨论

四、结论

全文总结

本研究的进一步安排

文献综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢