环形RNA形成机制及其作为退变性腰椎疾病合并骨质疏松症的诊断标志物潜能研究

摘要

环形RNA是一类新近被重新深入认识的非编码RNA分子。虽然，该类分子早在几十年前即被科学家所发现，但是多年以来，人们一直认为它是RNA剪接(RNAsplicing)过程中产生错乱剪接而导致的产物，或由一些特异性病原体，如肝炎病毒、植物类病毒等所产生。直到最近几年，随着分子生物学和计算生物学技术的进步和发展，才有越来越多的证据表明，环形RNA分子是一个庞大的家族，其结构稳定，在各种真核生物的组织、细胞中有着广泛的表达。
　　目前已知环形RNA分为外显子来源的环形RNA(circRNA)及内含子来源的环形RNA(ciRNA)两大类。外显子来源的环形RNA是由前体mRNA(precursormRNA)经过反向剪接(back-splicing)产生的，其中有一小部分该类环形RNA在剪接的过程中保留了部分内含子序列(intron retention)，虽然大部分环形RNA的表达水平相对较低，但是也有一些表达量比其所在基因的线性RNA的还要高出10倍多。而内含子来源的环形RNA表达量相对较低，该类环形RNA的产生源于内含子剪接后产生的套索结构(intron lariat)，其需要依赖特定的、保守的成环关键核酸序列，从而不被脱分支酶降解，是一类从形成机制和概念上与外显子来源环形RNA截然不同的一类新分子。
　　但这两类环形RNA都有着重要的基因表达调控作用。外显子来源的环形RNA，如circRNA CDR1可以作为“分子海绵”，利用其上具有的microRNA的结合位点对其进行吸附，从而影响目的基因的表达。已发现该类分子还具有其他功能，如可以通过与RNA结合蛋白作用等影响外显子环化或影响线性基因的表达。而内含子来源的环形RNA多定位在细胞核内，并可通过与RNA聚合酶Ⅱ复合体相互作用，从而调控其所在基因的转录速度。
　　在本论文中，研究的主要对象是外显子来源的环形RNA。已有研究表明，该类分子与多种疾病的发生相关。如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化疾病、病理性心肌肥厚和心力衰竭、骨关节炎、癌症等疾病。而环形RNA的存在并不是基因组转录过程中的错误，而是有其特有的机制。但其具体机制的研究尚存在空白。因此，本论文重点研究环形RNA形成的机制，并在此基础上，在转化医学方面，进一步探讨其作为疾病诊断标志物的潜能。
　　因此，我们首先通过体外分子生物学方法，成功的构建环形RNA的体外表达载体，并研究了外显子来源的环形RNA分子的一般特征。通过RNase R的富集作用，我们在人源胚胎干细胞H9的RNA-seq数据中，利用环形RNA研究工具CIRCexplorer找到了一批高可信度环形RNA，并选择其中的代表成功进行了体外验证。进一步的，我们确定了POLR2A基因上第9、10两个外显子形成的环形RNA作为深入研究的对象，将这两个外显子序列和其两侧的内含子序列构建到pZW1载体上，形成circRNA POLR2A体外表达载体，并通过Sanger测序确认了其构建序列的正确性，由Northern Blot实验证实了其表达的有效性，这为进一步深入其形成机制打下了坚实的基础。
　　在成功获得环形RNA体外表达质粒后，本论文第二部分以HeLa-J细胞为工具，通过一系列分子生物学手段对该质粒进行了改造和系统研究。Alu元件(Alu elements)占整个基因组序列的11％，是一种长约300bp的短重复序列，具有形成互补配对结构的潜能。研究者认为该互补序列对环形RNA的形成至关重要，因此进一步在已构建好的表达载体上对其内含子上的Alu元件进行了系统的缺失和替换突变。结果表明，互补序列是形成环形RNA的重要因素。综上，研究者首次揭示反向互补序列导致外显子环化的重要机制，并在此基础提出了“可变环化”的概念，以全新的理论角度更加深入的认识了基因转录调控的复杂性和多样性。
　　在对该类环形RNA分子的形成机制进行了深入的研究后，研究者进一步探索了环形RNA在临床转化研究中应用的可能，即研究其作为退变性腰椎疾病合并骨质疏松症诊断标志物的潜能。研究者首先建立了血浆/血清外泌子RNA研究体系，通过高通量测序技术及分子生物实验研究分析了其中环形RNA的表达和分布特点，结果显示，在4℃和25℃条件下，环形RNA在血浆/血清中48h内仍可以稳定存在，血浆中环形RNA的种类和表达量要明显高于血清外泌子来源的环形RNA，加之为了进一步减少血小板破裂释放出RNA的影响，研究者进一步选择了受试者的血浆样本作为后续研究的对象，通过已建立起的研究体系，筛选并鉴定了一组具有诊断生物标志物潜能的环形RNA，为进一步研究环形RNA与该疾病的关系打下了扎实的基础，为研究该疾病诊治新的靶点提供了有力的支持。
　　综上，本论文主要阐述了外显子来源环形RNA的形成机制，通过分子生物学和计算生物学方法，首次证实互补序列对外显子环化的重要作用，并提出“可变环化”的概念，以全新的理论形态丰富了基因转录/转录后水平调控的多样性和复杂性。在此基础上，我们进一步建立了体外研究血液外泌子来源的环形RNA的研究体系，分析了在血浆/血清中环形RNA存在、表达和分布的特点，并通过更进一步的分析研究，筛选了一组与退变性腰椎疾病合并骨质疏松症患者相关的环形RNA，证实其可作为该疾病潜在的诊断生物标志物。至此，研究者从生物学的基本问题入手，通过基础研究领域创新性的研究丰富了对该类环状分子的形成和调控机制的认识，并进一步延伸到临床转化研究水平，将基础研究的认识转入临床疾病相关的应用，做出了有益的初步探索。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

第一部分 环形RNA的特点及体外表达载体的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 环形RNA形成机制研究——反向互补序列介导的外显子环化

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 环形RNA作为退变性腰椎疾病合并骨质疏松症诊断标志物的潜能研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢