P2X7受体在结肠炎相关性结肠癌进展过程中的作用及机制研究

摘要

研究目的：
　　P2X7受体是以ATP配体的离子通道，由3个同源亚基组成，每个亚基有两个穿膜结构域、一个大的胞外环、一个短氮端和一个长碳端。P2X7受体在上皮细胞以及免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、淋巴细胞等显著表达，ATP/P2X7受体可以诱导免疫细胞产生许多生物活动，如增强吞噬功能、诱发炎性小体形成、促进炎性介质释放等，与炎症反应密切相关。在炎症性肠病(inflammatory boweldisease，IBD)动物模型，P2X7受体发挥明显的促炎效应。
　　近年来还发现，P2X7受体在众多肿瘤组织表达显著，而且肿瘤微环境ATP含量丰富，可以激活P2X7受体。研究表明P2X7受体对众多肿瘤的生长有重要影响，甚至还在肿瘤的侵袭转移过程中发挥作用。结肠炎相关性结肠癌(colitis-associatedcancer，CAC)与IBD关系密切，是典型的炎症相关的肿瘤。CAC为肠道上皮源性的肿瘤，研究也证实结肠癌细胞表达P2X7受体。P2X7受体可以通过调节炎症反应间接影响肿瘤进展，也可直接影响肿瘤细胞的生长。本文旨在研究P2X7受体在CAC进展过程中的作用及机制。
　　研究方法：
　　1.结肠炎相关性结肠癌模型的建立
　　在给予6-8周的雌性C57BL/6N小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)12.5mg/kg后，分别在第2、5、8周给予2.5％的葡聚糖硫酸钠（dextran sulphatesodium，DSS）饮用水，其余时间给予正常饮用水，总共造模时程为10周。
　　2.Western Blot
　　10μl蛋白样品上样于SDS-PAGE胶。电泳（100V，150min）、转膜(300mA，90min)。用5％的脱脂牛奶TBST溶液室温下封闭1hr。配制待检测蛋白的抗体孵育，4℃轻摇过夜。TBST洗膜。根据一坑种属选择适当HRP结合的二抗室温孵育1hr。TBST洗膜。混合Luminol试剂的A液、B液，进行显色。
　　3.细胞系及细胞培养
　　本实验中HT29细胞购自上海和元生物技术有限公司。细胞培养所用的培养基为McCoy's5A完全培养基，细胞培养在5％CO2，37℃的细胞培养箱中。
　　4.细胞免疫荧光
　　配制溶液:2g蔗糖溶于50ml4％的多聚甲醛(PFA)，固定细胞。PBS洗细胞。加入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸盐缓冲液，在80℃的水浴锅中煮20min，取出，室温下自然冷却。PBS洗细胞。一抗孵育，4℃过夜。PBS洗细胞。二抗避光孵育1hr。PBS洗细胞。加入Hoechst33258染色液染细胞核，室温10min。PBS洗细胞。用甘油封片保存，荧光显微镜下观察拍照。
　　5.细胞活力检测
　　待测样品加入CCK溶液，细胞培养箱中孵育2hr。用酶标仪测定450nm处的吸光值。
　　6.细胞增殖检测
　　待测样品加入BrdU溶液，细胞培养箱中孵育4hr。去除上清液，加入Fixing/Denaturing溶液，室温下静置30min。去除上清液，加入BrdU抗体溶液，室温下静置1hr。去除上清液，用Wash Buffer洗细胞。加入HRP结合的二抗，室温下静置30min。去除上清液，用Wash Buffer洗细胞。加入TMB底物，室温下静置30min。加入终止液，用酶标仪测定450nm处的吸光值。
　　7.细胞凋亡检测
　　消化细胞，用PBS洗涤，收集细胞。Binding Buffer悬浮细胞。加入FITC AnnexinV混匀，室温避光孵育15min。加入PI混匀，室温避光孵育4min。用流式细胞仪检测细胞凋亡。
　　8.细胞周期检测
　　消化收集细胞，弃上清，PBS洗涤细胞。加入75％乙醇，混匀，4℃过夜。离心收集细胞，弃上清，PBS洗涤细胞。加入PI/Rnase Staining Buffer混匀，室温避光孵育40 min后用流式细胞仪检测细胞周期。
　　研究结果：
　　1、P2X7受体特异性拮抗剂BBG减缓了CAC小鼠的体重恢复，降低了CAC小鼠的生存率，促进了CAC小鼠肠道肿瘤的形成及CAC模型小鼠肠道肿瘤组织STAT3的磷酸化。
　　2、P2X7受体激动剂BzATP抑制了CAC小鼠肠道肿瘤的形成和CAC模型小鼠肠道肿瘤组织STAT3的磷酸化。
　　3、P2X7受体在HT29细胞呈阳性表达。
　　4、P2X7受体激动剂BzATP引起HT29细胞空泡化。
　　5、P2X7受体激动剂BzATP引起HT29细胞G1期阻滞，抑制了HT29细胞的增殖，导致HT29细胞活力降低，而对细胞凋亡无明显影响。
　　6、P2X7受体激动剂BzATP抑制了HT29细胞STAT3的磷酸化。
　　研究结论：
　　1、P2X7受体在小鼠CAC进展过程中发挥一定的抑制作用。
　　2、人结肠癌细胞的P2X7受体可能通过抑制STAT3的磷酸化而抑制肿瘤细胞的增殖。
　　3、P2X7受体激活可导致小鼠CAC肠道肿瘤组织STAT3磷酸化水平的降低，这可能是P2X7受体介导的抑制CAC进展的重要机制。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

前言

材料与方法

一、主要仪器与试剂

二、实验方法

实验结果

一、P2X7受体特异性拮抗剂BBG对CAC小鼠的影响

二、P2X7受体激动剂BzATP对CAC小鼠的影响

三、P2X7受体相关分子对小鼠CAC肿瘤形成的影响

四、P2X7受体在人结肠癌细胞HT29中的作用及其分子机制

讨论

结论

参考文献

综述(1)P2X7受体的结构、分布、信号通路、功能及在疾病中的作用

综述(2)P2X7受体与炎症性肠病

学习期间发表的论文

致谢