GnRH神经元表达GAD67及性激素对其影响的研究

摘要

促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神经元在前脑散在分布，其在生殖过程中有着极其重要的作用。GnRH的脉冲式释放受神经递质或神经调质调控。γ-氨基丁酸（Gamma-amino butyric acid，GABA）是中枢神经系统(centralnervous system，CNS)中最主要的抑制性神经递质，但是在大多数发育成熟的GnRH神经元中，则起着相反的作用，即兴奋作用。谷氨酸(glutamic acid)在谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）的作用下，脱羧成GABA。GABA通过作用于GnRH神经元上的GABAa和GABAb受体，使GnRH神经元表现出兴奋或者抑制现象。我们利用免疫荧光组织化学方法和GAD67-GFP基因敲入小鼠(GAD67-GFPknock-in mice，GAD67-GFP)进行研究，首次发现在成年小鼠的前脑中部分GnRH神经元表达GAD67，即这一细胞亚群是GABA能的。
　　在我们的工作中，首先利用原位杂交和免疫荧光组织化学联合方法验证GAD67-GFP基因敲入小鼠GFP表达的特异性。结果显示GAD67在中枢神经系统中广泛分布，如大脑皮层、丘脑网状核、苍白球等区域，并且绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)免疫反应阳性的神经元与GAD67 mRNA完全共标，说明GAD67-GFP基因敲入小鼠中GFP的表达具有特异性，可以用GFP代替GAD67来显示GAD67的表达。
　　运用免疫荧光组织化学法，发现在成年小鼠的前脑中部分GnRH神经元表达GAD67。经统计学分析，结果显示雌鼠和雄鼠前脑中GAD67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比分别为62％±7％、34％±5％，即雌鼠前脑中GAD67与GnRH共表达的神经元所占百分比明显高于雄鼠。
　　为了研究不同性别之间的差异，我们对雌鼠和雄鼠进行了去势手术及性激素的替代治疗。发现雌鼠在摘除卵巢7天后，GAD67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比是40％±4％，明显低于正常雌鼠，而摘除卵巢后用雌二醇(17β-estradiol，E2)治疗的雌鼠前脑中该种神经元所占百分比为64％±5％，基本恢复到正常雌鼠的水平。但是，在雄鼠对照组、摘除双侧睾丸以及摘除睾丸后用睾酮丙酸盐(testosterone propionate，TP)治疗的实验结果显示，GAD67与GnRH共表达的神经元所占的百分比分别是34％±5％、36％±5％、35％±4％，并没有明显的差异。说明GAD67在GnRH神经元中的表达受雌激素的影响。
　　因此，我们又对雌鼠的动情周期进行了相应的研究。首先利用阴道脱落上皮细胞涂片法辨别小鼠的动情期和非动情期，然后进行免疫组织化学实验。我们发现出生后30天(postnatal day30，P30)和45天(P45)的雌鼠在动情期时，GAD67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比分别是71％±4％、75％±4％，明显高于非动情期（P30:34％±5％;P45:34％±5％）。再次证明了GnRH神经元表达GAD67受雌激素的调节。
　　成年小鼠前脑中，部分GnRH神经元表达GAD67。而在胚胎发育过程中，胚胎12天（Embryo day12，E12）时，犁鼻器（vomeronasal organ）和GnRH神经元的迁移路径中基本所有的GnRH神经元都表达GAD67;随着时间的推移，在迁移路径以及中枢神经系统中，GAD67与GnRH共表达的神经元数目均是越来越少。而且在P1和P10，均未看到GnRH神经元表达GAD67。直到P15时，才看到有GnRH神经元表达GAD67;P30时（通常认为是性成熟阶段），雌鼠和雄鼠前脑中GAD67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比开始出现明显的差异。
　　总之，我们的研究数据表明:1、在成年小鼠前脑中，部分GnRH神经元表达GAD67。2、在GnRH神经元中，GAD67的表达受雌激素的调节。3、结果提示:GnRH神经元合成和分泌γ-氨基丁酸，并通过作用于GnRH神经元上的受体调节自身的功能活性。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

材料与方法

一、实验材料

(一)实验所用仪器

(一)实验所用试剂

(三)实验所用试剂盒

(四)实验所用抗体

(五)实验所用缓冲溶液及其他溶液的配方

二、实验方法

(一)动物实验方法

(二)动物组织的制备

(三)组织冰冻切片法

(四)免疫荧光组织化学(immunofluorescence histochemistry，IHC)

(五)原位杂交组织化学方法(in situ hybridization，ISH)

(六)原位杂交与免疫荧光组织化学联合法

(七)拍照、定量分析和数据处理方法

实验结果

(一)GAD67-GFP基因敲入小鼠GFP表达的特异性

(二)在成年小鼠前脑中，部分GnRH神经元表达GAD67

(三)GAD67-GFP基因敲入小鼠前脑中，GAD67-GFP与GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元百分比的性别差异

(四)GAD67-GFP基因敲入雌鼠和雄鼠进行去势手术及手术后分别用E2、TP治疗对GAD67-GFP与GnRH共表达的影响

(五)GAD67-GFP基因敲入雌鼠在动情周期中，GAD67-GFP与GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元百分比的差异

(六)GAD67-GFP基因敲入小鼠在胚胎及出生后发育过程中GAD67-GFP与GnRH共表达情况

讨论

参考文献

综述

在校期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢