GnRH及其受体在卵巢上皮性癌的表达及GnRH激动剂对卵巢癌增殖与凋亡影响的研究

摘要

目的：卵巢上皮性癌（简称卵巢癌）恶性程度高，在妇科恶性肿瘤中死亡率最高，多数患者发现时已是晚期，虽然采取手术和化疗等治疗方法，晚期卵巢癌患者五年生存率仅30％，卵巢癌的病因尚不明确，深入研究其发病机制可能为临床治疗开辟新的途径。促性腺激素释放激素（GnRH），是由下丘脑弓状核神经细胞合成和分泌的十肽激素，与脑垂体内促性腺激素细胞膜上受体特异性结合，从而调节性腺内受体形成和激素功能。大量流行病学调查证明，卵巢癌的发生与高促性腺激素水平刺激和过度排卵有关。GnRH存在多种亚型，研究显示只有GnRHⅠ（哺乳动物GnRH）与GnRHⅡ（鸡GnRH）基因出现在人类基因组。其相应受体GnRHⅠ受体和GnRHⅡ受体的基因也在人基因组中被发现。下丘脑内有GnRH的分布。GnRHⅠ：（pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2）表达在下丘脑和人精子顶体区域、垂体前叶组织和癌细胞中及胎盘组织中。GnRHⅡ：pGlu-His-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2）在脑组织以外高表达，特别是肾、骨髓和前列腺中，另外在胎盘和胎儿肾上腺高表达。GnRH捆绑于垂体一个特定的G蛋白耦联受体上调节合成和分泌促性腺激素。GnRH受体多肽分布在中枢海马等部位，并可广泛存在于一些许多激素依赖性肿瘤中，如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等。GnRH主要有两种形式的受体，即GnRH-Ⅰ R，GnRH-Ⅱ R。GnRH类似物是在天然GnRH分子结构进行修饰而合成的一系列肽类物质，包含激动剂和拮抗剂两类。对GnRH及其受体功能和作用机制的深入研究将为卵巢癌临床治疗开辟新的途径。
　　 方法：
　　 1.卵巢上皮性肿瘤细胞中的GnRHⅠ、GnRHⅡ及其受体表达及意义。采用免疫组化SP法，检测22例卵巢良性上皮性肿瘤以及39例卵巢癌中GnRHⅠ、GnRHⅡ及GnRH受体的表达。分析卵巢上皮性癌组织中GnRHⅠ、GnRHⅡ及其受体表达与患者年龄、肿瘤病理类型、手术病理分期、组织分化、等临床病理特征和预后的关系。
　　 2.曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3增殖与凋亡影响的探讨。选用不同浓度曲普瑞林刺激卵巢癌细胞OVCAR3后，采用MTT方法检测其对细胞的增殖活性的影响。采用流式细胞术检测曲普瑞林作用于细胞后凋亡情况。运用RT-PCR的方法，检测曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3中凋亡相关因子Caspase-3的表达的影响及GnRH1受体、GnRH2受体表达的影响。
　　 3.曲普瑞林对荷卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用研究。利用OVCAR3细胞腹腔注射建立裸鼠移植瘤模型，分别用OVCAR3和低剂量曲普瑞林同时注射裸鼠腹腔，OVCAR3和高剂量曲普瑞林同时注射裸鼠腹腔，接种14天后处死荷瘤裸鼠，观察腹腔移植瘤成瘤情况及毒副反应。
　　 结果：
　　 1.GnRHⅠ和GnRH受体的定位及分布：卵巢上皮性肿瘤组织免疫组织化学SP染色特异性良好。卵巢上皮性肿瘤组织中GnRHⅠ阳性产物大多位于细胞浆和细胞膜，胞核内无阳性产物；卵巢上皮性肿瘤组织中GnRH受体阳性产物也大多位于细胞浆和细胞膜，胞核内无阳性产物。卵巢良性上皮性肿瘤GnRHⅠ阳性表达率（54.5％）低于卵巢癌中GnRHⅠ的表达（79.5％）.差异有统计学意义；病理分级中G1级卵巢癌组织GnRHⅠ的阳性率（50％）低于G2级卵巢癌组织GnRHⅠ的阳性率（91.7％），差异有统计学意义；G3级卵巢癌组织中GnRHⅠ阳性表达率为（93.3％），与G2级卵巢癌组织表达差异无统计学意义。卵巢良性上皮性肿瘤中GnRHⅡ蛋白表达阳性率（100％），与卵巢癌组织表达（100％）差异无统计学意义。卵巢良性上皮性肿瘤中GnRH受体阳性表达率（81.8％）高于卵巢癌（53.8％），具有统计学意义；病理分级中G1级卵巢癌组织GnRH受体的阳性率（16.7％）低于G2级卵巢癌组织GnRH受体的阳性率（58.3％），有统计学意义；G3级卵巢癌组织中GnRH受体阳性表达率为（80.0％），与G2级卵巢癌组织表达差异无统计学意义。GnRHⅠ及GnRH受体表达率与恶性上皮性肿瘤组织学分级有关。其分级越高，GnRHⅠ及GnRH受体表达率亦越高，与病理类型、分期、年龄无关。GnRHⅠ阳性患者平均生存期（21.22±2.63）月小于GnRHⅠ阴性者（35.43±5.57）月，有统计学意义（logrank值=4.63）。GnRH受体阳性者平均生存期（18.75±2.49）月小于GnRH受体阴性者（31.06±4.34）月，有统计学意义（logrank值=5.39）。GnRHⅠ及GnRH受体的表达阳性者与卵巢癌不良预后有关。
　　 2.卵巢癌细胞OVCAR3有GnRH两种受体的表达，曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3增殖有抑制作用，MTT结果显示，10-7mol/l浓度的曲普瑞林作用细胞24h后，其增殖抑制率为（41.07±0.43）％，随着浓度的增加（10-6mol/l，10-5mol/l，10-4mol/l，10-3mol/l，10-2mol/l），增殖抑制率逐渐增加，分别为（50.56±0.76）％，（69.86±1.05）％，（65.43±0.87）％，（62.09±1.24）％，（58.69±0.87）％；以10-5mol/l浓度的曲普瑞林增殖抑制率最高，有统计学意义；以10-5mol/l浓度的曲普瑞林作用于细胞24h，48h，72h后，增殖抑制率分别是（69.86±1.08）％，（58.69±0.98）％，（48.56±1.02）％，最终是作用时间在24h时，抑制率最高，有统计学意义。曲普瑞林可诱导卵巢癌细胞凋亡。10-6mol/l，10-5mol/l，10-4mol/l曲普瑞林作用于OVCAR3细胞24h后调亡率逐渐增加，分别为（12.97±1.28）％，（25.81±2.73）％，（29.82±12.87）％，有统计学意义。曲普瑞林作用后使细胞凋亡相关因子Caspase-3表达增加①10-4mol/l，10-5mol/l，10-6mol/l曲普瑞林细胞作用于OVCAR3细胞24h后，Caspase-3的OD值分别是（0.51±0.04），（0.71±0.07），（0.41±0.04），与对照组细胞的OD值（0.33±0.02）相比，Caspase-3于曲普瑞林在10-5mol/l浓度时，表达量最高，有统计学意义；②10-4mol/l，10-5mol/l，10-6mol/l曲普瑞林作用于OVCAR3细胞48h后，Caspase-3的OD值分别是（0.69±0.07），（1.01±0.08），（0.64±0.08），与对照组细胞的OD值（0.48±0.04）相比，Caspase-3于曲普瑞林在10-5mol/l浓度时，表达量最高，有统计学意义；③10-4mol/l曲普瑞林细胞作用于OVCAR3细胞24h，48h后，Caspase-3的OD值分别是（0.85±0.09），（0.62±0.06），与对照组细胞的OD值（0.34±0.04）相比，Caspase-3在10-4mol/l曲普瑞林作用24h时表达量最高，有统计学意义；④10-5mol/l曲普瑞林作用于OVCAR3细胞24h，48h后，Caspase-3的OD值分别是（0.85±0.09），（0.64±0.05），与对照组细胞的OD值（0.40±0.06）相比，Caspase-3在10-5mol/l曲普瑞林作用24h时表达量最高，有统计学意义；⑤10-6mol/l曲普瑞林细胞作用于OVCAR3细胞24h，48h后，Caspase-3的OD值分别是（0.96±0.08），（0.68±0.04），与对照组细胞的OD值（0.58±0.04）相比，Caspase-3在10-4mol/l曲普瑞林作用24h时表达量最高，有统计学意义。曲普瑞林可提高细胞GnRH受体1表达水平升高。曲普瑞林作用于OVCAR324h时，在10-5mol/L GnRH R1表达最高。曲普瑞林作用于细胞后，GnRH R2的表达升高，在曲普瑞林10-5mol/L浓度作用于细胞24h后表达量最高。
　　 3.高剂量曲普瑞林明显抑制裸鼠腹腔移植瘤生长，对内分泌有影响。高剂量曲普瑞林组腹腔移植瘤个数和体积明显少于对照组其他2组。低剂量曲普瑞林组腹腔移植瘤个数和体积略少于对照组，但无统计学差异。高剂量组血清雌激素明显低于其他2组，血清促卵泡素明显高于其他2组。
　　 结论：GnRH自分泌旁分泌系统与卵巢癌的发生有关。GnRHⅠ及GnRH受体的卵巢癌预后不良。曲普瑞林对于GnRH受体阳性的卵巢癌细胞有增殖抑制作用。曲普瑞林作用于卵巢癌细胞，可诱导细胞发生凋亡，凋亡相关因子Caspase-3的表达量增多。 GnRH受体1、GnRH受体2表达增加与曲普瑞林抗增殖作用有关。高剂量曲普瑞林明显抑制卵巢癌腹腔种植，对内分泌有影响。总结实验可以推断，深入研究GnRH激动剂作用机制可能为临床治疗卵巢癌开辟新的途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

声明

引言

第一部分 卵巢上皮性肿瘤中的GnRHⅠ、GnRHⅡ及其受体的表达及意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分GnRH激动剂曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3增殖与凋亡的影响的探讨

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分曲普瑞林对荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长的影响

前言

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 促性腺激素释放激素及类似物研究进展

致谢

个人简历