SIRT1在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用及机制研究

摘要

研究背景及目的：
　　糖尿病肾病是导致终末期肾病的最主要病因，超40％的肾脏替代治疗患者是由糖尿病引起。临床主要表现为大量蛋白尿。研究认为蛋白尿的产生与肾小球足细胞损伤密切相关。在糖尿病肾病中，有多种因素如高血糖、血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)等导致足细胞凋亡。严格控制血糖及应用肾素-血管紧张素系统(RAS)阻断剂能够明显减少尿蛋白的产生。
　　SIRT1是一种沉默信息调节因子，具有NAD+依赖的去乙酰化酶活性，参与了多种疾病的发病过程，其中也包括糖尿病肾病。在糖尿病肾病中，SIRT1参与了炎症、细胞凋亡、纤维化等多个病理过程。在细胞凋亡方面，既往研究发现，高糖和Ang-Ⅱ可以通过不同的信号通路影响SIRT1的表达及活性，Ang-Ⅱ诱导内皮细胞凋亡并激活了P38/SIRT1通路。高糖培养可以激活足细胞中的AMPK/SIRT1通路介导细胞凋亡。在临床应用中，奥美沙坦能够减少糖尿病肾病患者尿蛋白，但是在血糖控制不佳的患者中，奥美沙坦降低尿蛋白的作用并不明显。说明高糖状态下奥美沙坦的治疗会受到影响。也提示高糖和Ang-Ⅱ可能通过不同通路诱导了足细胞凋亡。因此我们设想，在糖尿病肾病中，Ang-Ⅱ和高糖可能通过不同的信号通路（P38/SIRT1通路与AMPK/SIRT1通路）影响SIRT1的表达，从而导致了足细胞的凋亡，而奥美沙坦只能对P38/SIRT1通路起作用。
　　奥美沙坦是临床常用的血管紧张素Ⅱ抑制剂，能够抑制Ang-Ⅱ与血管紧张素Ⅱ受体的结合。既往认为Ang-Ⅱ主要通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，尤其是ERK1/2信号通路诱导足细胞凋亡。而Ang-Ⅱ是否也能通过P38/SIRT1通路介导足细胞凋亡目前缺乏相关报道。
　　研究方法：
　　1.动物实验:糖尿病肾病模型db/db小鼠为糖尿病组，并分成两组:安慰剂组（db/db+ CMC）和奥美沙坦组(db/db+OM)，C57BL小鼠作用为非糖尿病组(WT)，每组10只。在小鼠10-12周龄时，开始药物灌胃处理，安慰剂为0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)，奥美沙坦剂量为每天20mg/kg。在处理的第0、2、4、6、8、10、12周测尾静脉血糖并收集24小时尿液测尿蛋白。第12周处死动物，留取肾组织做病理切片及提取组织蛋白，通过western blot分析蛋白通路变化。
　　2.细胞实验:在33℃条件下，条件永生化小鼠足细胞可以进行传代培养，并且需要在培养基(RPMI1640)中添加10％牛血清和1×104U/L的γ干扰素;在37℃条件下细胞开始分化，分化完成需要14天，分化时培养基中不加γ干扰素。分化完成后给予葡萄糖、Ang-Ⅱ、奥美沙坦等刺激处理，收集细胞用流式细胞仪检测凋亡或提取蛋白用WesternBlot方法分析通路变化。
　　3.统计学处理:所有数据结果用均数±标准差（(x)±s）表示，利用Graphpad Prism5.0软件进行数据统计分析和制图。组间的差异分析方法采用one wayANOVA，定义P值＜0.05为差异有统计学意义。
　　研究结果：
　　1.奥美沙坦治疗12周后可以减少db/db小鼠的尿蛋白，而不影响小鼠的体重和血糖。在db/db小鼠肾脏组织中，奥美沙坦明显抑制p38/SIRT1通路，减少了足细胞的凋亡，但对AMPK没有影响。
　　2.奥美沙坦能部分抑制高糖激活的AMPK/SIRT1通路，减少足细胞凋亡。
　　3.Ang-Ⅱ激活p38/SIRT1通路诱导足细胞凋亡，而奥美沙坦明显的抑制这条通路，保护足细胞;P38抑制剂s8307具有类似作用。
　　结论:
　　本课题验证了SIRT1在糖尿病肾病足细胞中具有重要的保护作用。高糖通过AMPK途径抑制SIRT1活性诱导足细胞凋亡;血管紧张素Ⅱ通过p38/SIRT1通路触发了足细胞的凋亡。奥美沙坦能够抑制Ang-Ⅱ/p38/SIRT1通路，减少足细胞凋亡，降低糖尿病肾病小鼠尿蛋白;P38抑制剂s8307具有类似作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 SIRT1在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用与机制

一 实验动物与材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第二部分 SIRT1在高糖诱导足细胞凋亡中的作用与机制

一、实验材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第三部分 SIRT1在Angiotensin-Ⅱ诱导足细胞凋亡中的作用与机制

一、实验材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

全文讨论

参考文献

综述 SIRT1在治疗糖尿病肾病中的研究进展

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