海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrosttin-SN1的结构优化和抗炎机制研究

摘要

蛇毒成分复杂，含有丰富的活性肽和蛋白，这些蛋白和多肽类活性物质具有广泛的毒理和药理作用，其中就包括抗炎和免疫调节作用，但具体哪些成分起作用尚未有报道且机制更少有研究。中医自古就有以蛇入药治疗类风关等自身免疫疾病的历史，而青环海蛇作为我国珍贵的药用资源，是李时珍著《本草纲目》收集入药的17种蛇中的其中一种，已广泛用于治疗风寒湿痹、关节疼痛、屈伸不利、皮肤瘙痒、体虚和小儿营养不良等病症。海蛇提取物多次被证明对免疫系统具有双向调节作用，对大鼠佐剂诱导的关节炎、巴豆油诱导的耳肿胀、醋酸致小鼠疼痛都有一定的治疗效果，临床上使用复方海蛇胶囊改善大脑认知功能障碍和风湿性关节炎，这些研究结果都表明海蛇中的活性物质具有抗炎作用。但其抗炎活性成分及其作用机理未明，且作为海洋生物活性物质，其分子结构有可能是最佳效力结构，能够为我们提供药物合成和筛选的导向。
　　本课题组在前期工作基础中，利用噬菌体展示技术以人重组肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(hrTNFR1)为底物淘选青环海蛇蛇毒毒腺T7噬菌体展示文库，获得了一种靶标特异的活性肽(Hydrostatin-SN1)，体外结合实验表明:Hydrostatin-SN1能够与TNF-α的两种受体结合，BIAcore分析显示与TNFR1、TNFR2的结合解离常数分别为32μM和220μM，能显著改善小鼠急性结肠炎模型和小鼠急性休克模型的疾病进展。但SN1作为22个氨基酸的多肽，结构比小分子大、合成成本高;与传统抗体药物相比分子量小、半衰期短、易降解，而且结合能力弱，这些缺点制约了SN1的应用性。为进一步探究SN1是否含有与TNFR1特异性结合的关键序列，以便有针对性地对SN1进行结构优化以更好地选择性结合单一受体、提高活性、延长作用时间等，为研发选择性肿瘤坏死因子受体拮抗剂奠定基础。
　　目的:
　　分析Hydrostatin-SN1中与TNFR1特异性结合的关键序列;通过结构优化获得活性更强的多肽;评价多肽在体内外的抗炎效果。
　　方法:
　　1、使用结构模拟在线服务器对Hydrostatin-SN1的生物信息学进行分析，利用Discovery Studio2.5软件包中的Builder程序，以从头搭建的方法展示短肽。利用蛋白分子对接(Dock proteins)的方法模拟短肽与TNFR结合后所形成的复合物的结构，通过分子力学与分子动力学优化后，获得SN1与TNFR1的结合构象。分析构象中的结合位点，确定SN1与受体结合的关键序列，同时获取构象中氨基酸的作用方式及结合能量。
　　2、通过MTT方法分析短肽抑制TNF-α介导的细胞毒效应以初步筛选有活性的短肽，在体内应用LPS诱导的急性休克模型初步验证短肽的抗炎效果，分析这些短肽与SN1在序列上的关系。
　　3、蛋白质相互作用仪（BIAcore）分析短肽与TNFR1的结合能力，ELISA检测其与TNF-α竞争性结合TNFR的能力。
　　4、体外分析SN10对TNF-α激活HEK293A细胞的阻断作用，RealTime-PCR检测TNF-α诱导IL-8表达的变化，WesternBlot分析细胞中NFκB和MAPKs信号通路的变化。体内采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型进一步研究其抗炎效应和作用机制。
　　5、为提高多肽的半衰期和结合TNFR1的效价，决定构建SN10与人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白表达载体，利用真核和原核系统表达目的蛋白，在体外检测其拮抗TNF-α诱导的细胞毒效应。
　　6、为增强SN10对TNF-α的拮抗效应，将SN10与TNF-α拮抗肽WQ9的部分序列结合，形成突变肽SN12(DEFHLELHLYQSW)并分析SN12的体外抗TNF活性。
　　结果:
　　1、根据分子对接的结果，按照均分片段法截短22个氨基酸的Hydrostatin-SN1，使用MTT方法检测各截短多肽抑制TNF-α的细胞毒效应，发现SN10的抑制率显著高于其他截短多肽(p＜0.05)，同时SN10能显著提高LPS诱导的急性休克模型中小鼠的生存率。提示DEQHLETELH是SN1结合TNFR1的一段核心序列。
　　2、通过RT-PCR技术检测HEK-293A细胞中IL-8的变化，结果表明SN10在10-20μM的剂量范围内能剂量依赖地抑制IL-8的表达。BIAcore证实SN10与TNFR1有结合能力(Kd=2.775μ M)，但竞争性结合实验却显示SN10不能直接抑制TNF-α与TNFR的结合。为验证SN10结合TNFR1后能否影响TNF-α激活的下游通路，通过Western blot技术分析了SN10对TNF-α诱导的NFκB和MAPK通路的影响，SN10对IκB、P38和ERK的磷酸化有显著的抑制作用。
　　3、采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型，探讨SN10的体内抗炎效应，发现SN10治疗组的小鼠急性结肠炎各项病征，如体重变化、结肠炎相关疾病活动指数、结肠长度变化等都要好于模型组。HE染色结果表明SN10能改善结肠的炎症程度和病变范围，Real-time PCR结果证实它对结肠组织中相关促炎因子的表达具有抑制效果。结肠组织中NF-κB及MAPKs信号通路的变化进一步说明SN10作为一种TNFR1结合肽，对TNF-α激活相关炎症信号通路的下调作用，从而起到减轻和治疗炎性肠道疾病。
　　4、为了增强SN10结合TNFR的效价并延长其半衰期，我们构建了SN10与hIgG-Fc原核和真核表达载体，对原核表达蛋白做了初步纯化，初步纯化的蛋白在100μg/ml的高浓度下能提高L929细胞的存活率(p＜0.05)。收集并检测不同时间点真核细胞表达的上清，真核表达的融合蛋白能在1-5μg范围内剂量依赖地抑制TNF-α介导的细胞毒作用。
　　5、将SN10的序列与WSQYL结合后获得多肽SN12，SN12的抗TNF细胞毒效应强于单独的SN10和WSQYL，能显著抑制TNF-α和TNFR的结合，显著下调TNF-α诱导的内皮细胞趋附分子ICAM和炎症因子IL-8的表达，抑制NFκB和MAPK通路的激活。
　　结论:
　　对海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1的结构进行模拟分析，通过序列比对后截短多肽，利用MTT法检测细胞毒抑制效应，筛选获得10个氨基酸的短肽SN10。BIAcore证实SN10与TNFR1具有结合能力，体内外实验显示SN10具有一定的抗炎活性，机制主要通过抑制Ⅰ型受体下游通路的激活，从而影响炎症因子的表达。此外，将SN10与人免疫球蛋白IgG的Fc片段连接形成融合蛋白能提高其抗TNF-α活性，将SN10与WSQYL序列结合后获得突变肽SN12也进一步增强其抗炎效应。这些发现拓展了我们对海蛇蛇毒多肽抗炎机理的认识，也是寻找和改造TNFR1抑制剂的一次尝试。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验材料和试剂

一、实验材料

实验方法

一、蛇毒多肽Hydrostatin-SN1的截短和抗炎活性分析

二、SN10和人免疫球蛋白Fc片段融合蛋白的构建与表达

三、SN10与TNF拮抗肽的拼接和突变

四、数据分析

实验结果

一、SN1的结构模拟与虚拟对接

二、截短后各短肽对TNF-α介导的细胞毒的影响

三、SN10与TNFR1的亲和力分析

四、SN10抑制HEK-293A细胞IL-8的表达

五、S10对TNF-α介导的NF-κB及MAPKs通路的影响

五、SN10对脂多糖诱导的小鼠急性休克模型的影响

六、SN10抑制葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎

十一、pet28a-SN10-Fc表达载体的构建与鉴定

十二、SN10-hIgG-Fc的诱导表达和初步纯化

十三、真核表达pcDNA3．1-SN10-Fc的构建和鉴定

十四、融合蛋白SN10-Fc体外抑制细胞毒效应

十五、拼接肽抑制TNF-α介导的细胞毒性效应

十六、SN12能竞争性抑制TNF-α与TNFR1和TNFR2的结合

十七、SN12抑制TNF-α诱导的促炎细胞因子mRNA表达

十八、SN12抑制TNF-α下游信号通路的激活

十九、SN12显著抑制p-P65的核转位

讨论

结论

参考文献

综述 肿瘤坏死因子受体选择性拮抗剂的研究进展

发表论文和工作情况

致谢