通过调控Smad3诱导自噬减轻脓毒症肺损伤作用机制研究

摘要

研究背景：
　　脓毒症是临床最常见的严重创伤、烧伤以及大手术后之的并发症，短时间内可发展成为多器官功能障碍综合征，是当前创伤、烧伤和外科危重病人死亡的最主要原因。其中脓毒症相关急性肺损伤不但出现最早、发生率最高，而且进展迅速，病死率可高达70％～90％，目前并无有效治疗手段。
　　我们在前期研究中发现脓毒症背景下Smad3可以降低重要脏器对LPS的敏感性。同时研究发现TGF-β/Smad信号通路与自噬密切相关，而自噬是广泛存在于真核细胞的生命现象，具有吞噬病原体、调解炎症反应、减轻细胞凋亡等作用。因此我们认为Smad3对脓毒症的保护机制和自噬反应密切相关。
　　另外，Smad3的表达与活化还能够受到转录后水平的调节，这一类的调节因素主要是由非编码RNA包括microRNA介导的，而外泌体作为人体内一类重要囊泡，其中包含的主要是非编码RNA（miroRNA，LncRNA等）。研究发现细胞会通过分泌外泌体囊泡将信号分子传递到较远的组织或细胞中发挥调控作用。但是在脓毒症的微环境中，肺组织细胞释放的外泌体中是否包含影响Smad3表达与活化的microRNAs，并且进一步影响到脓毒症患者预后的研究，目前尚未见报道。
　　鉴于Smad3在脓毒症中发挥保护作用，利用现有药物样本库筛选针对Smad3本身活化的临床药物亦是防治脓毒症的策略之一。在未获得Smad3拟效剂的情况下，以脓毒症致病机制的关键信号通路——LPS-TLR4通路着手展开针对脓毒症防治的研究。
　　综上所述，我们利用Smad3基因缺陷小鼠探讨Smad3在脓毒症肺损伤中和自噬的关系，同时通过利用临床脓毒症患者血清标本，查找靶向调控Smad3的外泌体miRNAs，最后通过筛选通路抑制剂药物来综合探讨脓毒症防治新策略。
　　第一部分 Smad3调控自噬减轻脓毒症肺损伤的作用研究
　　研究目的:通过建立体内外Smad3(-/-)小鼠脓毒症肺损伤模型，观察smad3敲除后自噬相关基因表达的变化。
　　研究方法:体内实验通过气道滴入LPS构建脓毒症急性肺损伤模型，体外实验通过慢病毒包装构建稳定干扰Smad3的BEAS-2B细胞系，然后LPS刺激建立体外模型，通过电镜、HE染色、免疫组化以及ELISA，qPCR、蛋白免疫印迹法等分子生物学方法观察炎症损伤情况以及检测自噬相关基因的表达变化。
　　研究结果:1.Smad3基因敲除后小鼠脓毒症肺损伤加重，肺干湿重比增加（*p＜0.05）;HE染色KO组肺泡塌陷更多，出血明显，中性粒细胞浸润较WT组更多;ELISA检测小鼠血清和肺泡盥洗液TNF-a和IL-6的表达明显高于WT对照组(*p＜0.05)。
　　2.损伤早期(6h)电镜下KO组自噬小体形成明显增加，但自噬蛋白LC3 mRNA水平表达下降（*p＜0.05），蛋白水平却表达增加;
　　3.成功构建si-Smad3 BEAS-2B细胞系，发现6h时自噬蛋白LC3B LPS-shSmad3组较LPS-NC组表达明显上调。
　　结论:Smad3敲除后小鼠脓毒症肺损伤加重，自噬增加。Smad3可能通过调控自噬来降低肺对LPS的易感性。
　　第二部分外泌体miRNAs调控Smad3减轻脓毒症肺损伤
　　研究目的:利用小RNA高通量测序和基因芯片技术检测动物和患者血清外泌体，筛选出靶向调控Smad3的miRNAs，并验证其调控自噬的机制。
　　研究方法:以Smad3（-/-）小鼠构建气道滴入LPS脓毒症急性肺损伤模型，收集小鼠肺组织一部分通过WB检测Smad3活化情况，一部分进行高通量测序，提取血清和肺泡盥洗液外泌体进行基因芯片检测，再结合临床脓毒症患者不同时期的血清外泌体进行小RNA高通量测序，通过组间差异分析以及聚类分析等生物信息学手段筛选受Smad3调控的下游miRNAs和靶向调控Smad3的上游miRNAs，最后用BEAS-2B细胞系体外实验进行验证目的miRNA是否调控自噬。
　　研究结果:1.脓毒症小鼠急性肺损伤6h之后，Smad3磷酸化表达显著升高。
　　2.肺组织测序发现Smad3敲除之后，miR-574-5p表达减少，而血清和肺泡盥洗液外泌体基因芯片检测发现KO/WT表达增高的有miR-1196-5p，miR-574-5p，但miR-1196在肺组织测序中没有检测到。
　　3.在LPS刺激下，miR-574-5p模拟物外源性刺激BEAS-2B细胞系，自噬表达上调;而用miR-574-5p抑制剂可以抑制自噬的表达。
　　4.脓毒症患者血清外泌体小RNA测序后组间差异分析发现对照组和烧伤后10天患者的血清外泌体miRNA相比，有显著差异p＜0.01的共有69个;和烧伤后20天的患者血清外泌体miRNA比较，两组有显著差异p＜0.01的共有74个;和烧伤后30天组相比，两组有显著差异p＜0.01的共有42个。
　　5.时间序列分析筛选出差异表达下降的miRNAs，再进行靶基因预测发现和 smad3，LC3B同时相关的一共有5个，分别是miR-9-5p,miR-3135b,miR-432-5p,miR-409-3p,miR-744-5p。经体外细胞系RAW264.7脓毒症模型验证其表达量，发现变化趋势和临床脓毒症患者血清基本一致。
　　结论:1.小鼠脓毒症肺损伤早期Smad3缺失导致自噬上调，其机制可能与肺上皮细胞分泌miR-574诱导自噬发生有关。
　　2.smad3基因在临床脓毒症患者中发挥的保护作用可能与上游靶向调控它，的miRNAs下降有关。
　　第三部分 LPS-TLR4信号通路抑制剂DMF防治脓毒症机制
　　研究目的:分子层面探索DMF抑制LPS-TLR4信号活化的机制并验证其对脓毒症的防治作用。
　　研究方法:从临床药物库筛选LPS-TLR4通路抑制剂DMF，利用LPS刺激RAW264.7细胞，设不同的DMF浓度梯度组，采用免疫蛋白印迹检测NFkB信号通路中4个关键蛋白的活化情况。最后以LPS腹腔注射构建脓毒症模型，通过动物生存率实验观察其对脓毒症的防治效果。
　　研究结果:1.RAW细胞经LPS刺激后DMF干预组，NO浓度依次降低，iNOS表达受到抑制;同时DMF抑制LPS-TLR4通路下游IKK，IkB，NFkB磷酸化表达，而IRAK蛋白表达没有变化。
　　2.生存率时间效应梯度实验发现只有术前给药36h和48h能达到50％的生存率，（*p＜0.05），生存率剂量效应梯度实验证实DMF30mg/Kg可以提高小鼠脓毒症生存率50％，15mg/Kg可以提升25％（*p＜0.05）。
　　3.体内外实验证明DMF可以有效抑制炎症因子TNF-a，IL-6，IL-10的表达（*P＜0.05），另外HE染色显示脓毒症背景下DMF处理组肺、肝、肾损伤较LPS损伤组明显减轻。
　　4.在DMF和UTI的联合作用下，促炎因子IL-6和IL-1β，抑炎因子IL-10转录和翻译水平均受到明显抑制，联合用药进一步提升脓毒症小鼠生存率90％-100％。
　　结论:DMF抑制LPS-TLR4信号通路的作用靶点在于抑制IKK蛋白磷酸化，并且可以有效防治脓毒症，联合乌司他丁可以进一步大幅度降低脓毒症死亡率接近于0。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 Smad3调控自噬减轻脓毒症肺损伤的作用研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

第二部分 外泌体miRNAs调控Smad3减轻脓毒症肺损伤

前言

材料和方法

实验结果

讨论

第三部分 LPS-TLR4信号通路抑制剂DMF防治脓毒症的作用机制研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

综述 脓毒症中的细胞自噬

参考文献

在读期间发表论文和专利

致谢