基于代谢组学策略的CKD-MBD相关生物标志物筛选及骨代谢毒性机制研究

摘要

慢性肾脏病矿物质骨代谢异常(CKD-MBD)是慢性肾功能不全的常见并发症，矿物质骨代谢异常表现为全身系统性紊乱，严重影响了患者的生活质量，特别是心血管事件的发生，极大的缩短了肾病患者的生存时间，增加了肾病患者的死亡率。然而目前的现状是，骨活检作为CKD-MBD诊断金标准却无法普及应用，现有的生化指标在疾病诊断方面存在滞后性，不够灵敏特异，因此寻找新的早期诊断标志物显得尤为重要;而蛋白结合类尿毒症毒素(PBUTs)因肾功能障碍在体内蓄积而常规透析又无法有效清除，且已有很多报道揭示其与CKD-MBD的发生发展相关，PBUTs作为潜在的高灵敏高特异性的生物标志物，目前有关其在肾病患者体内真实水平的评价标准却相对缺乏，另外PBUTs作为潜在的疾病早期诊断标志物，其在疾病发生发展过程中的毒性作用机制也尚不明确，也限制了治疗靶标及新药的发现。因此，本论文结合代谢轮廓分析与代谢靶向分析筛选鉴别矿物质骨代谢异常相关生物标志物，并对代表性的PBUTs进行准确定量，进一步以硫酸对甲酚(PCS)为例，整合转录组学与代谢组学，揭示PBUTs对骨代谢的可能毒性作用机制，主要内容如下:
　　1.本研究首先针对CKD-MBD全身系统性功能障碍的三种典型临床表现进行血清代谢轮廓分析，包括:(1)横断面研究:①基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析继发性甲旁亢（高转运骨病）患者与疾病对照组的代谢轮廓差异，共筛选到32个潜在的血清生物标志物，主要涉及蛋白合成及代谢，氨基酸代谢，能量代谢和甾体激素类代谢等代谢通路，以这些候选的生物标志物构建预测模型对继发性甲旁亢的诊断能力进行评估，预测结果显示准确度、灵敏度和特异性分别为71.1％、73.7％和68.4％，预测效能优异;②基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱的代谢轮廓分析，比较了严重及轻微尿毒症瘙痒症(UP)患者的血清代谢轮廓，结合多元及单变量统计分析方法筛选鉴别了22个与UP相关的显著差异代谢物，并经逐步回归分析在22个鉴别的差异代谢物群中筛选到9个差异代谢物联合构建预测判别模型，区分严重及轻微尿毒症瘙痒症患者时获得最大受试者工作特征曲线下面积(AUC=0.899)，灵敏度为85.1％，特异性为83.0％，预测效能优异;(2)干预研究:肾病患者矿物质骨代谢异常会引起血液系统功能障碍，肾性贫血是其临床表现，通过对不同静脉铁剂治疗响应的肾性贫血病人进行代谢轮廓分析，采用液质联用结合多元统计分析鉴别能够预测肾性贫血病人静脉铁剂治疗响应的潜在生物标志物油酰胺和抗坏血酸2-硫酸酯，联合两者构建预测模型对静脉铁剂治疗完全响应患者的预测准确率为87.5％，而对静脉铁剂治疗完全无响应患者的预测准确率为83.3％。这一预测模型的受试者工作特征曲线下面积为0.901，证明了油酰胺和抗坏血酸2-硫酸酯作为缺铁性贫血铁剂治疗响应评价指标优异的预测效能。以上研究基于LC-MS技术对矿物质骨代谢异常引起的骨骼系统（继发性甲旁亢）、血液系统（肾性贫血）以及皮肤（尿毒症并发瘙痒症）异常分别进行了血清代谢轮廓分析，筛选了CKD-MBD相关的血清生物标志物，为疾病的早期诊断、早期干预及治疗响应预测提供了新的评价指标。
　　2.接下来，基于前三章代谢轮廓分析结果与文献报道PBUTs群体与CKD-MBD相关的结论之间的差异，且针对目前缺少肾病患者体内PBUTs真实水平评价体系的现状，我们以目前已报道的PBUTs中代表性的15个（Nδ-羧甲基赖氨酸、戊糖素、犬尿氨酸、喹啉酸、犬尿喹啉酸、对羟基马尿酸、吲哚-3-乙酸、苯基葡糖醛酸、对甲苯酚葡糖醛酸、硫酸对甲苯酚、马尿酸、4-乙基苯硫酸、褪黑素、苯乙酸、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸）为分析目标，系统性的考察比较不同的蛋白沉淀试剂及不同类型的固相萃取小柱对血清中15种代表性的PBUTs的提取效率，并建立了基于LC-MS/MS在正负离子模式下以多反应监测模式(MRM)测定人血清中15种PBUTs的定量方法，定量方法通过方法学验证后对尿毒症患者群体及健康人群体内的PBUTs真实水平进行准确测定。我们的结果表明在所有前处理考察方案中，安捷伦的96孔除蛋白磷脂板孔内甲醇沉淀方法能提高血清中PBUTs的绝对响应，可应用于血清中尿毒症毒素定量分析时的前处理，定量测定结果表明与健康对照组相比，尿毒症患者的血清中15种PBUTs浓度显著升高，本研究为CKD-MBD代谢组学研究提供了一种新的样本前处理方法，而所构建的代表性的15个PBUTs的定量方法也扩展了我们对尿毒症群体血清中PBUTs真实水平的认识，我们的定量测定结果也表明了除PCS和IS之外的其他PBUTs的异常浓度与其可能的毒性作用。本研究聚焦PBUTs群体，优化样品前处理，建立PBUTs的定量方法，为揭示肾病患者体内PBUTs的真实水平提供了平台。
　　3.通过上述代谢靶向分析证明了PBUTs与CKD-MBD的发生发展密切相关，接下来，以PBUTs代表性成员PCS为示例，MC3T3-E1成骨细胞为研究对象，采用基于UHPLC-QTOF/MS技术的细胞代谢组学共鉴别PCS处理后成骨细胞中显著改变的74个代谢小分子，并采用代谢通路智能分析聚焦了代谢层面15个显著改变的代谢通路;采用基于转录组测序技术的转录组学方法共鉴别PCS处理后成骨细胞中3679个差异表达基因，并通过信号转导通路显著性分析聚焦转录层面显著改变的58条代谢通路，进一步聚焦代谢水平与转录水平显著差异代谢通路，发现谷胱甘肽代谢和甘油磷脂代谢两条信号通路在PCS处理后的成骨细胞中代谢水平和转录水平两个层面均显著改变，另外，基于IPA软件对导入的差异代谢物与差异表达基因数据富集分析PCS刺激导致的细胞生物学功能异常，结果表明PCS刺激后细胞凋亡功能上调，而细胞周期，DNA复制、重组与修复功能下调，这些富集的功能异常也与前期细胞活性，细胞凋亡与细胞周期测定结果一致。本研究为尿毒症毒素的骨代谢毒性作用机制研究提供了新的思路。
　　本课题通过代谢轮廓分析结合代谢靶向分析、代谢组学结合转录组学分析等多角度并联合各种生物信息学策略，筛选了CKD-MBD早期诊断、疗效评价的生物标志物，并聚焦蛋白结合类尿毒症毒素，建立尿毒症毒素体内真实含量的评价标准;同时进一步结合上游基因调控与下游功能分子响应多层次探讨了尿毒症毒素对骨代谢的可能毒性作用机制，为尿毒症毒素致病机制研究提供了新思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 综述

一、课题背景介绍

(一)慢性肾脏病-矿物质骨代谢异常的研究概况

(二)尿毒症毒素的研究概述

(三)代谢组学与转录组学

二、本研究的内容和意义

(一)本课题研究的内容

(二)本课题研究的意义

参考文献

第二章 基于UHPLC-QTOF／MS技术的继发性甲状旁腺亢进血清代谢组学研究

一、前言

二、材料与方法

(一)试剂与耗材

(二)实验样本的纳入与剔除

(三)血清样本收集与制备

(四)基于uHPLC-MS技术的血清代谢轮廓分析

(五)数据处理

(一)患者的临床信息

(二)统计分析结果

四、讨论

五、本章小结

参考文献

第三章 基于UHPLC-QTOF／MS技术的尿毒症并发瘙痒症血清代谢组学研究

一、前言

二、材料和方法

(一)试剂与耗材

(二)实验样本的纳入与剔除

(三)样品收集与制备

(五)数据处理

三、结果

(一)参与患者的临床资料

(二)血清代谢轮廓分析

(三)代谢标志物筛选

(四)UP生物标志物的诊断性能评价

四、讨论

五、本章小结

参考文献

第四章 基于UHPLC-QTOF／MS技术的血清代谢组学预测肾性贫血静脉铁剂治疗响应研究

一、前言

二、材料和方法

(一)试剂与耗材

(二)实验样本的纳入与剔除

(三)铁剂治疗方案

(四)不良反应记录

(五)血清生化指标测定

(六)样品采集和准备

(七)基于UHPLC-MS技术的血清代谢轮廓分析

(八)数据处理

三、结果

(一)参与患者的临床资料

(二)血清代谢轮廓分析

(三)代谢标志物筛选

(四)铁剂治疗响应相关代谢变量的预测效能评价

四、讨论

五、本章小结

参考文献

第五章 基于HPLC-MS／MS技术的人血清中15种蛋白结合类尿毒症毒素的定量方法学研究

一、前言

二、仪器与试剂

(一)仪器与设备

(二)试剂

三、方法与结果

(一)分析条件

(二)标准溶液的配制

(三)血清样品收集及样品制备

(四)方法学验证

(五)真实样本测定结果

四、讨论

(一)实验条件的初步探索与建立

(二)液相色谱条件的优化

(三)质谱检测条件优化

(四)血清样品前处理条件优化

(五)内标的选择

(六)空白基质的选择

(七)尿毒症毒素测定结果分析

五、本章小结

参考文献

第六章 硫酸对甲酚对成骨细胞损伤作用的转录组学与代谢组学研究

一、前言

二、实验材料与方法

(一)材料与仪器

(二)细胞培养

(三)细胞活性分析

(四)细胞凋亡测定

(五)细胞周期测定

(六)细胞实验

(七)代谢组学分析

(八)转录组学分析

(九)PCS导致生物学功能异常的富集分析

三、实验结果

(三)PCS对MC3T3-E1细胞周期影响

(四)代谢组学结果

(五)转录组测序结果

(六)整合转录组与代谢组代谢通路和相关生物学功能的显著性分析

四、讨论

五、本章小结

参考文献

全文总结

在读博士学位期间发表论文

致谢