沙门菌鞭毛蛋白增强T细胞表位肽免疫效果的研究

摘要

[研究目的]：
　　细菌鞭毛蛋白作为Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)的配体，可以作为载体佐剂与特异性抗原连接，诱导免疫反应，本课题首先介绍一种多肽-蛋白偶联的流程，并用多肽-蛋白偶联产物制备一种偶联疫苗，其次通过皮下注射免疫BALB/c小鼠，比较鞭毛蛋白与特异性抗原偶联组和鞭毛蛋白与特异性抗原混合组的免疫效果，证实重组鞭毛蛋白与特异性抗原偶联后可增强抗原特异性免疫应答。通过重组鞭毛蛋白增强T细胞表位肽免疫效果的研究，为自身免疫性疾病治疗性疫苗的研究做铺垫。
　　[研究方法]：
　　在前人制备已导入质粒pET28a-FliC-6His的BL21 E.coli菌种中提取重组鞭毛蛋白(recombinant Salmonella flagellin，rFliC)，经GE His GraviTrap提纯蛋白，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)分析蛋白的纯度和性质。用化学连接剂Sulfo-EMCS在作为载体蛋白的rFliC上加马来酰亚胺基团，用间接Ellman反应测定载体蛋白上所加的马来酰亚胺基团数。载体蛋白利用马来酰亚胺基团与人工合成的OVA323多肽上半胱氨酸反应形成稳定的硫醚键产生偶联，偶联反应结束后，经Ellman测定剩余巯基，计算出消耗的巯基数和载体蛋白上马来酰亚胺基团数相比，得出载体蛋白和多肽的偶联比。
　　为了检测多肽和载体蛋白偶联体对T细胞的免疫效果，用PBS、OVA323+rFliC（混合）、OVA323-rFliC（偶联）、OVA323+CFA/IFA分别免疫BALA/c小鼠，之后取小鼠脾脏，获取淋巴细胞，体外刺激。用酶联免疫吸附试验(Enzyme linkedimmunosorbent assays，ELISA)检测刺激后细胞上清中IL4、IFN-γ的分泌情况;用酶联免疫斑点吸附试验(Enzyme linked immunospot，ELISPOT)法检测获取的淋巴细胞在培养刺激过程中特异性分泌IL-4、IFN-γ的细胞数;用流式方法检测刺激后细胞CD4+IL-4+/CD4+IFN-γ+的细胞所占的比例。
　　实验结果统计分析利用SPSS22.0软件，组间分析使用单因素方差分析法，当P＜0.05时说明组间存在显著差异。随后使用邦弗伦尼法比较实验组间两两的差异，当P＜0.05时说明两组间存在显著差异，本实验所有统计学数据用均数±标准差表示。
　　[研究结果]：
　　通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导导入质粒pET28a-FliC-6His的BL21 E.coli菌种表达rFliC，成功的获取了高纯度的rFliC。经化学连接剂在每摩尔rFliC上添加约5.55摩尔的马来酰亚胺，用马来酰亚胺修饰的rFliC制备出了偶联比大约为5.84的OVA323-rFliC多肽-蛋白偶联产物。
　　ELISA检测发现，小鼠脾脏细胞体外刺激后OVA323-rFIiC免疫组IL-4、IFN-γ的表达量较PBS组和OVA323+rFliC组显著增高，且差异有统计学意义; ELISPOT检测发现，小鼠脾脏细胞体外刺激过程中OVA323-rFliC免疫组特异性分泌IL-4、IFN-γ的细胞数较PBS组和OVA323+rFliC组显著增高，且差异有统计学意义;流式细胞术分析发现，小鼠脾脏细胞体外刺激后OVA323-rFliC免疫组CD4+IL-4+、CD4+IFNγ+细胞比例(％)较PBS组和OVA323+rFliC组显著增高，且差异有统计学意义。
　　[主要结论]：
　　本研究将T细胞表位肽OVA323与rFliC体外偶联，构建OVA323-rFliC偶联体，并用偶联体免疫小鼠，通过检测T细胞特异性细胞免疫，证实rFliC可以作为T细胞佐剂，增强T细胞表位肽免疫效果，为rFliC作为自身免疫性疾病治疗性疫苗的载体佐剂的研究打好基础。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

引言

参考文献

第一部分 重组鞭毛蛋白表达纯化及偶联体的构建

一、前言

二、实验材料

三、实验方法与步骤

四、实验结果

五、讨论

参考文献

第二部分 重组鞭毛蛋白与多肽偶联增强T细胞免疫反应

一、前言

二、实验材料

三、实验方法与步骤

四、实验结果

五、讨论

参考文献

全文总结

综述 增强Treg免疫效果的佐剂的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢