沙门氏菌鞭毛蛋白B亚单位对不同IBDV免疫原免疫效果的影响

摘要

沙门氏菌鞭毛蛋白是构成菌体鞭毛的单体蛋白，它不仅是细菌运动和黏附的重要组成原件，也是天然Toll样受体5(Toll-like receptor，TLR)的激动剂，能够与TLR5结合激活MyD88信号途径，引起IL-8等细胞因子分泌增多，增强免疫细胞分化增殖等效应。虽然其本身具有沙门氏菌H抗原表位区域，却不影响其佐剂作用的发挥，甚至可作为自身佐剂增强鞭毛的抗原性，因此，自1998年其佐剂作用被发现以来，一直是疫苗免疫增强剂的研究热点，多项研究显示鞭毛蛋白能够增强原核和真核表达蛋白抗原的抗原性，通过对天然免疫因子的调节增强特异性免疫应答。干酪乳杆菌是安全级微生物(generally regarded as safe，GRAS)的益生菌，因其菌体成分和分泌物能够明显促进黏膜和体液免疫，亦是疫苗佐剂候选者。
　　本研究利用重组鞭毛蛋白的免疫增强作用，通过以传染性法氏囊病毒(IBDV)为抗原模型，探讨了鞭毛蛋白对不同形式疫苗的免疫增强作用，结合干酪乳杆菌外源蛋白表达系统无毒素残留、菌体及分泌成分具有益生作用的优势，以期获得纯化步骤简单、易于生产的重组鞭毛蛋白作为疫苗免疫佐剂的候选者。利用PCR方法以鼠伤寒沙门氏菌菌体为模板获得鞭毛蛋白B亚单位基因(FliB)，碱基序列经对比与GenBank上已公布序列NC_003197.1完全一致。有应用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法去掉FliB的高变区（171 aa～407aa），只保留氨基端和羧基端的保守序列，并插入柔性肽序列和酶切位点，获得截短的鞭毛蛋白FliBc，建立能够便捷插入不同抗原的免疫增强剂基因模型。将FliB和FliBc基因连接乳酸菌载体pPG-2载体构建重组干酪乳杆菌pPG-2-FliB/L.casei393和pPG-2-FliBc/L.casei393，诱导表达后获得分子量分别为53 kD和35 kD的分泌型重组蛋白，在体外检测其对人结肠癌上皮细胞Caco-2的TLR5刺激活性，结果显示细胞内IL-8表达量明显升高，说明表达的重组蛋白FliB和FliBc在体外具有生物活性，并且在培养条件相同情况下，单位体积内pPG-2-FliBc/L.casei393培养上清中蛋白的TLR5刺激活性强于pPG-2-FliB/L.casei393。本研究主要内容包括：
　　⑴为了检验截短后的FliBc表达的蛋白对VP2抗原是否有增强免疫的作用，将IBDV保护性抗原VP2基因插入重组质粒pProHTa-FliBc中，用大肠杆菌表达系统表达出VP2-FliBc融合蛋白，并与其他两种形式蛋白（单纯表达的VP2蛋白，分别表达的重组蛋白VP2和FliBc机械混合）分别加入弗氏佐剂制备出亚单位疫苗模型，免疫SPF雏鸡后检测各项指标，探讨构建的FliBc是否能够增强插入抗原引起的免疫反应，以及融合和混合与抗原配合使用的效果。检测免疫鸡血清中IgY效价，嵌合蛋白VP2-FliBc组明显显著高于VP2+FliBc混合组和VP2组，MTT法检测脾淋巴细胞增殖能力也明显高于VP2组，攻毒保护率较对照组也有所上升。证明FliBc与VP2抗原蛋白融合后免疫发挥了明显的免疫增强作用，也进一步验证前人的结论:FliBc与抗原融合表达免疫效果强于与抗原机械混合，因为FliBc在与抗原连接时能够更好的提呈抗原从而增强其特异性免疫应答。
　　⑵为探索鞭毛蛋白与活毒疫苗配合使用的免疫效果，本试验选用IBDV商品化弱毒疫苗（D78株）作为抗原模型，选用肌注(im)和滴鼻(in)两种方式免疫，分别与总蛋白含量相同的重组菌pPG-2/L.casei393、pPG-2-FIiB/L.casei393和pPG-2-FliBc/L.casei393上清共同免疫7日龄SPF雏鸡，只免疫一次。每周采血直至56日龄，检测免疫后血清中IBDV特异性IgY效价，结果显示两种途径pPG-2-FliBc/L.casei393上清组均具有最高效价，并且在49日龄免疫后SPF鸡用IBDV超强毒株(vvIBDV)进行攻毒，计算免疫保护率也明显高于对照组。pPG-2-FliB/L.casei393组也显示一定免疫增强作用，但效果不及截短的FliBc上清组。横向比较肌注免疫途径与滴鼻免疫途径，肌注方式的体液和细胞免疫应答强度均高于滴鼻组，但检测泪液和肠道粘液中的分泌型IgA(sIgA)水平，in组显著高于im组，说明鞭毛蛋白在黏膜途径免疫中具有够增强局部免疫的功能。检测免疫后血清中和抗体效价，im组整体水平高于in，最高中和效价达1∶100以上;相同免疫途径组内比较pPG-2-FliBc/L.casei393组显著高于对照组，而pPG-2-FliB/L.casei393组与对照组差异不显著。
　　⑶FliBc作为IBDV VP2基因乳酸菌活载体疫苗免疫增强剂的评价:将VP2-FliBc基因与pPG-2连接转化干酪乳杆菌L.casei393，用Western-blotting方法检测重组菌体和培养上清，均表达与预期相符的分子量约为76 kD的重组蛋白。将诱导后菌体培养至1010CFU/mL， pPG-2-VP2-FliBc/L.casei393和本实验室构建好的pPG-2-VP2/L.casei393，以及对照组pPG-2/L.casei393分别经口服途径免疫SPF雏鸡，并间隔10 d加强免疫两次，检测血清IgY特异性抗体效价，pPG-2-VP2-FliBc/L.casei393组高于pPG-2-VP2/L.casei393组;并且脾淋巴细胞增殖指数和攻毒后保护率也均高于pPG-2-VP2/L.casei393组。说明在IBDV VP2干酪乳杆菌活载体基因疫苗中插入FliBc基因，能够增强动物的体液和细胞免疫应答，具有免疫增强活性。
　　⑷建立了表达沙门氏菌全长鞭毛蛋白FliB和截短鞭毛蛋白FliBc的E.coli和干酪乳杆菌表达系统并正确表达了两种蛋白，通过L.casei393表达的两种重组蛋白体外活性比较，显示截短的FliBc的TLR5刺激活性强于FliB。同时建立三种形式IBDV疫苗模型:VP2亚单位疫苗、商品IBDV弱毒疫苗和VP2基因的乳酸菌活载体疫苗，将FliBc分别以蛋白和基因融合表达形式与三者配合使用，检测血清IgY、黏膜IgA及免疫保护试验评价免疫效果，说明FliBc无论在三种疫苗免疫中均发挥了增强体液和细胞免疫的作用，具有开发为免疫佐剂的潜能。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 沙门氏菌鞭毛蛋白的概况

1．1．1 鞭毛蛋白的结构与功能

1．1．2 鞭毛蛋白与天然免疫

1．1．3 鞭毛蛋白与获得性免疫

1．2 沙门氏菌鞭毛蛋白的佐剂作用

1．2．1 鞭毛蛋白作为佐剂的研究进展

1．2．2 鞭毛蛋白作为免疫增强剂在禽类免疫的研究

1．3 乳酸菌表达重组蛋白的优势

1．3．1 乳酸菌作为疫苗佐剂的潜能

1．3．2 乳酸菌作为活菌载体表达外源蛋白的研究

1．3．3 禽为模型的乳酸菌相关研究

1．4 IBDV疫苗的研究与应用

1．5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 病毒、细胞和抗体

2．1．2 实验动物

2．1．3 质粒和菌株

2．1．4 酶类及主要试剂

2．1．5 引物

2．1．6 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 FliB、FliBc和IBDV VP2基因片段的克隆

2．2．2 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E．coli表达载体的构建

2．2．3 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2在E．coli中表达和鉴定

2．2．4 乳酸菌表达载体pPG-2-FliB、pPG-2-FliBc和pPG-2-FliBc-VP2的构建

2．2．5 目的蛋白在干酪乳杆菌L．393中的诱导表达及鉴定

2．2．6 乳酸菌表达的重组蛋白体外活性检测

2．2．7 FliBc、VP2和FliBc-VP2重组蛋白的纯化和免疫

2．2．8 pPG-2-FliB/L．casei393和pPG-2-FliBc/L．casei393培养上清的处理并和IBDV弱毒疫苗配合的免疫

2．2．9 乳酸菌活载体疫苗的制备和免疫

2．2．10 疫苗免疫效果的评估

3 实验结果

3．1 IBDV VP2、FliB和FliBc基因的克隆

3．1．1 FliB和FliBc基因的克隆

3．1．2 IBDV VP2基因的克隆

3．2 FliBc、IBDV VP2和FliBc-VP2基因E．coli表达载体的构图

3．2．1 Ppro-HTa-FliB和Ppro-HTa-FliBc的构建

3．2．2 重组载体Ppro-HTa-VP2的构建

3．2．3 重组载体Ppro-HTa-FliBc-VP2的构建

3．3 重组E．coli的诱导表达和鉴定

3．3．1 鞭毛蛋白Fli的多克隆抗体的制备

3．3．2 E．coli表达重组蛋白FliB和FliBc的表达鉴定

3．3．3 Ppro-HTa-VP2／BL21的诱导表达和鉴定

3．3．4 Ppro-HTa-FliC-VP2／BL21的诱导表达和鉴定

3．4 重组乳酸菌载体的构建与鉴定

3．4．1 重组载体pPG-2-FliB的构建及鉴定

3．4．2 重组载体pPG-2-FliBc的构建及鉴定

3．4．3 重组载体pPG-2-FliB-VP2的构建及鉴定

3．5 FliB、FliBc和FliBc-VP2基因的乳酸菌表达及鉴定

3．5．1 pPG-2-FliB/L．casei393和pPG-2-FliBc/L．casei393的诱导表达

3．5．2 pPG-2-FliBc-VP2／L．casei393的诱导表达

3．6 乳酸菌表达的重组蛋白FliB和FliBc体外活性检测

3．6．1 重组乳酸菌表达蛋白的处理和检测

3．6．2 对Caco-2细胞表达TLR-5和IL-8水平的影响

3．7 FliBc对IBDV VP2亚单位疫苗佐剂活性的评估

3．7．1 亚单位疫苗重组疫苗的纯化

3．7．2 免疫SPF鸡血清中特异性IgY的测定

3．7．3 特异性脾淋巴细胞增殖试验

3．7．4 血清中和抗体效价

3．7．5 攻毒保护性试验

3．8 FliBc对IBDV弱毒疫苗佐剂活性的评估

3．8．1 免疫SPF鸡血清中特异性IgY的测定

3．8．2 特异性脾淋巴细胞增殖试验

3．8．3 中和抗体水平

3．8．4 攻毒保护试验

3．9 FliBc对IBDV活载体疫苗佐剂活性的评估

3．9．1 pPG2-VP2/L．casei393和pPG2-FliBc-VP2/L．casei393免疫SPF鸡血清特异性IgY的测定

3．9．2 特异性脾淋巴细胞增殖活性

3．9．3 泪液、气管灌洗液和肠粘液中分泌型IgA的测定

3．9．4 中和抗体水平检测

3．9．5 攻毒保护试验

4 讨论

4．1 重组目的蛋白表达条件的优化选择

4．2 鞭毛蛋白佐剂活性区域的选择

4．3 IBDV作为抗原模型的选择

4．4 鞭毛蛋白作为免疫佐剂对亚单位疫苗免疫增强效应

4．5 鞭毛蛋白对弱毒疫苗的免疫增强作用

4．6 鞭毛蛋白作为乳酸菌疫苗的分子佐剂的免疫增强作用

4．7 鞭毛蛋白应用的潜在价值

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文