Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究

摘要

研究目的：
　　明确慢性肾脏病(CKD)时ROCK1的激活是否刺激线粒体裂变增加，并参与慢性肾脏病肌肉萎缩的发生和发展;
　　研究方法：
　　体内动物实验:雄性，C57BL/6J小鼠，40只，按照实验处理方法的不同分成4组:假手术组（WT组），CKD组，假手术+Fasudil组（WF组），CKD+Fasudil组（CF组）;其中，WT组行肾脏包膜剥离术，CKD组行5/6肾脏切除术，1月后，两组老鼠行尾静脉取血，测血清尿素氮（BUN）及血清肌酐(Cr)水平，筛选CKD成模老鼠;将WT组和CKD组老鼠，随机分成上述四组，配对饲养;其中WT组和CKD组老鼠，行腹腔注射生理盐水（3次/周，持续8周），高蛋白饲料喂养;WF和CF组老鼠，腹腔注射Fasudil（30mg/kg/次，3次/周，持续8周），高蛋白饲料喂养。每周测量老鼠体重。实验结束后，按照实验目的和操作步骤，收取老鼠腓肠肌、胫骨前肌等下肢肌，用于免疫荧光染色及蛋白免疫应迹(Western Blot)或Real time-PCR，检测ROCK1、MuRF1等目标分子的表达情况，从而明确Fasudil能否逆转CKD所致肌肉萎缩及线粒体裂变相关蛋白的增加。体外细胞实验:体外培养C2C12成肌细胞，2％马血清诱导细胞分化成熟，腺病毒载体ROCK1刺激细胞过表达ROCK1，对照组给予腺病毒载体GFP（绿色荧光蛋白），，按照给予刺激的不同，实验分成四组:1）Ad-GFP组，给予腺病毒载体-GFP(AAV-GFP，5nmol/l);2)Ad-ROCK1组，给予腺病毒载体-ROCK1(AAV-ROCK1，5nmol/l);3)Ad-GFPF组，在给予GFP的前提条件下，给予Fasudil(10umol/l)刺激;4)Ad-ROCK1F组，在给予AAV-ROCK1前提下，给予Fasudil(10umol/l)刺激。各组病毒刺激持续48小时。通过细胞能量代谢分析仪(Seahorse)评估C2C12成肌细胞在不同刺激条件下时，细胞呼吸过程中耗氧量及产酸率的改变情况;通过染色，证实ROCK1过表达对C2C12成肌细胞线粒体形态和功能的影响;检测各组肌萎缩相关蛋白及线粒体裂变相关基因的表达的变化情况。
　　研究结果：
　　体内实验中，与WT组相比，CKD组老鼠，ROCK1表达增加，肌肉横截面积减少肌纤维分布左移，同时电镜下观察发现，CKD组老鼠线粒体裂变增加;CF组与CKD组相比，给予Fasudil腹腔注射老鼠，CKD所致肌肉横截面积减少不明显，肌纤维分布右移，肌萎缩相关蛋白MuRF及线粒体裂变相关蛋白p-Drp1表达减少。体外实验中，Seahorse检测线粒体应激变化时，Ad-ROCK组较GFP组细胞基础呼吸、最大呼吸、额外呼吸增加，给予FCCP刺激后，细胞呼吸的耗氧量及产酸率也明显增加;细胞线粒体染色观察到，Ad-ROCK组细胞线粒体裂变增加，表现为碎片化，线粒体裂变蛋白p-Drp1表达增加，而且活性氧的的释放增加;给予Fasudil刺激后，能明显改善ROCK1过表达所导致的p-Drp1，MuRF1、Atrogin1的增加，纠正细胞呼吸异常。
　　研究结论：
　　慢性肾脏病时，激活ROCK1，刺激线粒体裂变增加，增加活性氧释放，并增加细胞耗氧量和产酸率，影响蛋白的合成和降解速率，参与肌肉萎缩的发生;Fasudil作为ROCK1的抑制剂，能够在一定程度上阻断ROCK1通过激活p-Drp1所引起的线粒体裂变增加，从而阻断由此继发的一系列不良影响，并最终实现改善肌肉肌肉萎缩的目的，为临床防治慢性肾脏病肌肉萎缩提供新的思路及方法。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

课题设计

一、体内实验

二、体外实验

三、统计学处理

实验装置与方法

一、实验仪器与耗材

二、实验试剂

三、实验方法

实验结果

一、慢性肾脏病(CKD)导致肌肉萎缩

二、慢性肾脏病(CKD)激活ROCK1，导致线粒体裂变增加，促进肌肉萎缩的发生

三、Fasudil阻断ROCK1过表达所致细胞呼吸异常，改善CKD所致肌肉萎缩的发生

分析与讨论

结论

参考文献

综述 慢性肾脏病与线粒体功能异常

在读期间发表论文情况

致谢