晚期结直肠癌中血浆ctDNA与肿瘤组织标本RAS/BRAF突变状态的一致性分析及其对EGFR单抗的疗效预测价值研究

摘要

基于基因检测的肿瘤分子分型及个体化治疗方案可使转移性结直肠癌患者获得最佳的治疗效果和最小的不良反应。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的单克隆抗体联合标准化疗已成为转移性结直肠癌的常规治疗模式。EGFR单克隆抗体治疗前，需强制性检测肿瘤组织的RAS(KRAS、NRAS)、BRAF突变基因状态。RAS突变是目前仅知的具有真正临床意义的EGFR单抗治疗mCRC的独立耐药预测因素。此外BRAF、PIK3CA、EGFR、HER2等基因可能与EGFR单抗治疗mCRC的原发性及继发性耐药相关，依据这些基因的改变可预测EGFR单克隆抗体的疗效。
　　结直肠癌基因检测取材于肿瘤组织，组织获取为有创性操作，在同一例病人无法反复多次进行，这就意味着在组织标本丢失、不足或疾病进展而活检困难时无法准确的为患者制定个体化的治疗方案，这也限制了原发性耐药及继发性耐药的分子机制研究。因此，临床上探讨适用范围广、痛苦小、准确度高、成本低的基因检测方法显得至关重要。
　　循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)基因检测是一项非侵入式检测肿瘤的“液体活检”技术，相对于传统的组织活检简单、易行、高重复性，更易被患者接受。ctDNA是肿瘤细胞通过凋亡、坏死或者自分泌的形式释放至外周血的游离DNA，其携带的肿瘤基因组信息与肿瘤组织具有良好的一致性，能克服常规肿瘤组织活检所无法突破的肿瘤异质性问题。目前，ctDNA基因突变检测方法有基于聚合酶链式反应的技术和下一代测序(next-generation sequencing NGS)技术相关的方法，具有较高敏感性。通过ctDNA检测，能帮助实时动态监测肿瘤原发灶及转移复发灶基因信息，协助疗效监测、预后判断，也有助于靶向治疗适应症的评估，从而推进精准医疗的实施。
　　目的:检测mCRC患者血浆ctNDA中RAS(KRAS、NRAS)/BRAF基因突变状态，与临床上标准方法检测肿瘤组织标本的结果进行比较，分析其一致性及存在差异的原因，探讨血液检测替代组织检测的可行性。同时动态监测西妥昔单抗治疗前和治疗过程中患者ctNDA中KRAS、NRAS、BRAF等基因突变状态的变化，预测患者是否对EGFR单克隆抗体治疗已出现耐药，为指导临床用药提供依据。
　　方法:①收集自2015年10月份至2016年12月份有治疗前组织标本的KRAS、NRAS、BRAF基因检测结果的mCRC患者98例，其中有5例患者未接受过任何治疗，10例患者接受了原发灶姑息性切除手术，83例患者接受过一线以上化疗。肿瘤组织标本基因检测采用Amoy-Dx试剂盒。血浆ctDNA采用NGS技术中Ion Torrent个人化操作基因组测序仪检测KRAS、NRAS、BRAF突变状态。②收集首次或正在接受西妥昔单抗治疗的KRAS、NRAS、BRAF野生型mCRC患者25例，检测治疗前或疗效评估时血浆ctNDA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、EGFR、HER2、EGFR基因状态。
　　结果:①血浆ctNDA与肿瘤组织标本中KRAS突变型与野生型的一致性为65.3％(Kappa=0.229，p=0.009)。血浆ctDNA与肿瘤组织标本中NRAS、BRAF的一致性分别为95.9％、93.7％。实验结果表明，血浆ctDNA与肿瘤组织标本中的KRAS、NRAS、BRAF突变状态的一致性尚可，但KRAS突变状态的一致性却低于既往的文献报道，分析原因可能为本研究所选的患者多为治疗后的患者，治疗可改变肿瘤内基因突变状态，同时也证明了实时血液检测的必要性。②25例肿瘤组织KRAS、NRAS、BRAF为野生型的患者，检测抗EGFR单抗治疗前或疗效评估时血浆ctDNA，有13例患者检测到KRAS、NRAS、PIK3CA或EGRF突变。其中10例患者疗效评估为进展。另有3例患者疗效评估为稳定或缓解，但数月后影像学检查显示出病变进展。实验结果表明，血浆中耐药基因出现提示患者已对抗EGFR治疗耐药。如在治疗前血浆检测出相关耐药基因突变，应避免使用EGFR单抗。如在治疗过程中检测到相关耐药基因突变，尽管影像学检查尚未显示病情进展，但提示已发生耐药，临床医生可提前调整治疗方案，以获得更好疗效。
　　结论:本研究显示NGS技术检测血浆ctDNA与肿瘤组织标本中KRAS、NRAS、BRAF突变状态的一致性尚可，这为mCRC治疗中血液检测代替组织检测提供了理论依据。液体活检比组织活检具有更高的灵敏度，可作为组织活检的补充，筛选出对EGFR原发耐药的患者。化疗和分子靶向治疗改变了肿瘤内的基因状态，因此对于使用抗EGFR单抗治疗的mCRC患者，实时液体活检监控KRAS突变、NRAS突变等相关耐药基因的出现，可早于影像学评估发现继发性耐药，从而及时调整后续的治疗措施。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 mCRC中血浆ctDNA与肿瘤组织标本RAS／BRAF基因突变状况的一致性分析

一、研究对象

二．资料与方法

三、统计学方法

四、结果与分析

五．讨论

第二章 mCRC中检测ctDNA对EGFR单抗的疗效预测价值研究

一、研究对象

二、材料与方法

三、统计学方法

四、结果与分析

五、讨论

参考文献

ctDNA在结直肠癌临床诊疗中的应用及价值

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致谢