组蛋白去乙酰化酶Sirt1抑制剂的抗移植排斥机制研究

摘要

器官移植是绝大部分器官衰竭患者的最终治疗手段。大量证据表明CNI类药物的出现有效改善了器官移植物的短期存活率。自CNI类药物应用于临床后，急性排斥发生率大幅下降，患者1年存活率极大提高。但是长期服用CNI类药物也会导致各类药物副作用，如肾毒性、神经毒性，并导致感染和癌症的患病风险增加。因此，目前普遍观点认为CNI类药物对于预防移植物排斥是不可或缺的，但其服用剂量应适当减少。
　　传统的移植免疫学认为来自供者或受者的抗原提呈细胞通过直接途径或间接途径激活T淋巴细胞，随后Th细胞分泌IFN-γ、IL-2和其它细胞因子从而介导了移植排斥的发生。基于此种理论，CNI类药物通过结合FKBP12阻止NF-AT的激活，从而阻止IL-2基因的转录。
　　最近有研究表明Th17和Treg细胞之间的平衡与同种异体移植物排斥反应的发生密切相关。Th17细胞对于急性和慢性排斥的发生十分重要，而Treg细胞又对于诱导和维持受者对移植物的免疫耐受至关重要。但是CNI类药物无法有效抑制由Th17细胞所介导的排斥反应，甚至有研究表明CNI类药物会导致Th17/Treg的失衡。因此，调节Th17/Treg平衡是目前最有前景的预防排斥反应的诊疗目标。
　　近几年表观遗传学越来越受到免疫学家的重视，它被认为是对免疫细胞进行精确调控的有效机制，移植免疫学家甚至认为通过此种调控可以有效抑制慢性排斥。Sirtuins是NAD+依赖的第三类组蛋白去乙酰化酶，其在转录调控、新陈代谢、细胞老化、细胞自噬/凋亡、自身免疫、氧化应激、炎症等各项生理过程中均扮演着重要角色。Sirtuins家族共有七位成员，其中Sirt1对于各类在机体免疫功能发挥重要作用的转录因子起着重要的调控作用。
　　最初的研究认定Sirt1在免疫过程中主要发挥着抗炎作用。但是近年来聚焦T淋巴细胞的研究实验表明Sirt1在免疫应答过程中发挥着重要的促炎作用。一方面，Sirt1可以对Foxp3蛋白这一Treg细胞的特异性转录因子去乙酰化从而负性调控Treg细胞的免疫功能;另一方面，Sirt1还可以通过调节RORγt的活性正向调控Th17细胞的功能。基于此种研究背景，Sirt1也许是一个新的移植排斥反应的治疗靶点。
　　作为Sirt1抑制剂，sirtinol关于抗肿瘤和抗炎效果的药理作用已有报道，但是它对于同种异体移植物排斥反应以及分子机制尚无报道。在本次实验中，我们建立了颈部异位心脏移植模型，并观察sirtinol对移植物的抗排斥作用，最终发现了sirtinol对于Th17细胞的抑制作用和对Treg细胞的正向调控作用，以及它与FK506联用后可协同增强对排斥反应的抑制效果。
　　第一部分: Sirt1抑制剂sirtinol抗移植排斥作用的研究探讨
　　为了明确sirtinol在移植排斥反应中的作用机制，我们建立了MHC错配的颈部异位心脏移植模型，以BALB/C小鼠为供体、C57BL/6为受体进行移植后腹腔注射sirtinol（1mg/kg/天），并设立DMSO对照组。结果发现DMSO组的移植物生存期最长延长至8天，而sirtinol组的移植物生存期最长延长至13天。随后我们在第7天获取移植心脏进行病理分析发现sirtinol组较DMSO组炎性细胞浸润明显减少。此结果表明sirtinol对移植心脏具有明显的保护作用，但具体机制尚不清除。然后我们研究了sirtinol对各类细胞炎症因子和调控分子的影响作用。移植物在移植7天后取出进行定量PCR分析。考虑到Th细胞在急性排斥中发挥主导作用，因此我们首先进行了IL-2、IFN-γ、 IL-4、IL-10、IL-17A和Foxp3的定量PCR分析，了解它们在移植物的表达情况。结果发现，sirtinol组中IL-17A的表达水平较DMSO组而言明显下降，而Foxp3的表达水平明显上升。IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达情况在各组之间没有明显差异。免疫荧光实验也发现了同样结果。考虑到Foxp3在Treg细胞中的重要地位。我们对DMSO组和sirtinol组受者体内Treg细胞的分化情况进行了分析。结果显示，sirtinol组中脾脏的Treg细胞比例升高。后进行胞内IFN-γ、 IL-4和IL-17A的染色分析各类Th细胞亚群比例，结果发现Th17细胞的比例在sirtinol组中明显下降，而Th1、Th2细胞比例没有明显差别。ELISA检测血清中IL-17A的含量也得到同样结果。以上结果显示sirtinol可以抑制IL-17A的产生，我们后又进行Th17细胞和Treg的诱导分化，并加入sirtinol和DMSO相互比较。培养一段时间后，通过流式分析得知，加入sirtinol的培养皿中Th17的分化受到了明显抑制，而Treg的分化比例明显增高，后通过western blot得知了sirtinol组中RORγt的表达量明显减少，而Foxp3的表达量显著升高。定量PCR也同样验证了这一结果，在sirtinol组中RORγ和IL-17A的表达量明显下降，而Foxp3明显上升。通过以上实验我们得出结果，sirtinol通过调节Th17和Treg之间的平衡来发挥抗移植物排斥效果，延长移植物的生存周期。
　　第二部分：sirtinol的临床应用初步探究
　　因为sirtinol和CNI类药物对于抑制排斥有不同的作用机制，因此我们将二者联用，给予心脏移植小鼠并观察移植心脏的生存周期。结果发现，低剂量的FK506(0.5mg/kg/d)联合sirtinol(1mg/kg/d)最长延长移植物生存时间为24天，而低剂量FK506的延长时间最长为18天，正常剂量FK506延长时间最长为22天。我们还观察了sirtinol对慢性排斥反应的影响作用，结果发现sirtinol(1 mg/kg/d)能够有效的延长CAV模型中移植心脏的生存周期，慢排小鼠模型移植心脏最长生存时间为78天，而FK506组与DMSO组相比在移植心脏的最长生存周期为52天和48天。这表明了sirtinol在抗慢性排斥中可以发挥重要作用，并提示我们sirtinol成为免疫抑制剂并应用于临床具有极大的潜力。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验所需试剂

实验所需仪器、耗材

第一部分 Sirt1抑制剂sirtinol抗移植排斥作用的研究探讨

一、实验方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 siritnol的临床应用探究

一、实验方法

二、结果

三、讨论

全文总结

本研究的进一步安排

综述 Sirtuin1相关的免疫信号通路与免疫细胞

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢