甲烷饱和盐水对慢性炎性痛模型大鼠镇痛作用的研究

摘要

研究目的:
　　慢性炎性痛，是临床病理性疼痛的主要类型之一，如果得不到及时而有效的治疗，将成为一个代价高昂的健康问题，不但降低了病人的生活品质，另一方面也带给病人个体、家庭及政府沉重的经济及社会负担，因此慢性炎性痛防治是一个重大的公共卫生问题。而由于其病理生理机制复杂，临床表现复杂多变，给临床实践（临床诊断与治疗）和基础科学研究带来重大的挑战与机遇。既往研究表明，氧化应激与神经炎症均是慢性炎性痛发病的主要机制之一。在外周组织损伤、感染或肿瘤生长的情况下，脊髓胶质细胞活化合成分泌多种炎症介质和氧化应激产物、降低抗氧化能力，这些因素互相作用，构成局部炎症微环境，最终改变突触传递的可塑性，从而形成了中枢敏化。其主要表现为自发痛，痛觉过敏和痛觉异常。
　　甲烷(CH4)，无色无味，分子量小，结构简单，是天然气和煤气等气体燃料及可燃冰的主要成分。甲烷可以通过哺乳动物肠道中的厌氧菌利用食物中的碳水化合物无氧酵解产生。由于吸入甲烷混合气存在易爆危险，目前研究多采用甲烷饱和盐水研究其生理作用。有研究发现，在低氧条件下，甲烷可在大鼠肝脏线粒体和真核细胞中生成，并具有抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡的作用;而这些作用在后续的缺血再灌注、脓毒症和结肠炎等模型中得到证实，并显示其具有神经保护作用。然而甲烷是否对大鼠慢性炎性痛具有治疗作用尚未见报道。本研究拟观察甲烷对完全弗式佐剂诱导的慢性炎性痛的痛行为学的影响，探索其可能的作用机制。
　　研究方法:
　　本研究采用CFA注射至大鼠踝关节致炎建立大鼠慢性炎性痛模型，运用免疫组织化学法、流式细胞术、western blot及ELASA等实验方法，依下面所述步骤初步观察甲烷饱和盐水对慢性炎性痛大鼠的痛行为的作用，探索其相关作用机制。
　　一、观察甲烷饱和盐水对慢性炎性痛大鼠痛行为的影响
　　选择SD大鼠(体重约200-300g)建立单关节炎慢性炎性痛模型。观察MA大鼠在单次腹腔内或者重复腹腔内注射甲烷饱和盐水后，术测后足机械痛缩腿反应阈值(Paw withdrawal threshold，PWT)变化情况。
　　二、观察甲烷饱和盐水对慢性炎性痛大鼠胶质细胞活化的影响
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷饱和盐水或者生理盐水后，术后第10d取同侧脊髓背角，用免疫蛋白印迹技术检测星形胶质细胞特异性标志物GFAP及小胶质细胞特异性标记物IBA1的表达水平。探讨甲烷饱和盐水是否通过调节胶质细胞活性来治疗慢性炎性痛。
　　三、观察甲烷饱和盐水对于慢性炎性痛大鼠脊髓外周T淋巴细胞浸润的影响
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷饱和盐水或者生理盐水后，术后第10d取脊髓腰膨大，用流式细胞术检测脊髓腰膨大节段中T细胞数量。探讨甲烷饱和盐水与慢性炎性痛大鼠外周T淋巴细胞脊髓浸润的关系。
　　四、观察甲烷饱和盐水对脊髓氧化应激水平的影响
　　建立慢性炎性痛模型后，用分光光度法检测术后第0d、3d、7d、10d同侧脊髓背角氧化应激的标记物超氧化物歧化酶(Superoxyde dismutase:SOD)及过氧化氢酶(catalase:CAT)活性及丙二醛(malonaldehyde:MDA)浓度，用免疫组织化学的方法术后第10d检测同侧脊髓背角细胞内氧化应激水平即8羟基脱氧鸟苷(8OHDG)表达情况。初步分析甲烷饱和盐水是否通过抗氧化应激途径来影响慢性炎性痛。
　　五、观察甲烷饱和盐水对于慢性炎性痛大鼠脊髓炎症介质的表达的影响
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷饱和盐水或者生理盐水后，用酶联免疫吸附实验检测第10d同侧脊髓背角中炎性因子（白介素1β、肿瘤坏死因子α、白介素10）的表达情况;探讨甲烷饱和盐水能否抑制脊髓背角炎症介质的表达。
　　研究结果:
　　一、甲烷饱和盐水可以显著提高慢性炎性痛大鼠机械痛缩腿反应阈值
　　与NS处理相比，单次MS(10ml/kg)经腹腔注射后(SD大鼠分两组，术后第3天分别接受NS或MS腹腔注射，间隔2天后分别接受MS或NS腹腔注射)可暂时升高MA大鼠的PWT，差异具有统计学意义(p＜0.05);这种效应具体表现为在处理后1h达到峰值，而后开始降低，总有效时间大约4h。而MS连续给药（术前1h及术后每天给药一次，共计11次）于术后第3天开始可显著提高大鼠的PWT，并至少持续到第10天(p＜0.05)。
　　二、甲烷饱和盐水可抑制胶质细胞的活化
　　踝关节致炎后同侧脊髓背角小胶质细胞和星型胶质细胞显著活化(p＜0.05)。与生理盐水组相比，甲烷饱和盐水组大鼠术侧脊髓背角中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度显著降低(p＜0.05)。
　　三、甲烷饱和盐水可抑制外周T淋巴细胞的脊髓浸润
　　与假手术组相比，踝关节致炎能够诱导外周T淋巴细胞向同侧脊髓背角浸润，差异具有统计学意义(p＜0.001)。与生理盐水组相比，甲烷饱和盐水组大鼠术侧脊髓背角中CD3+T细胞占单核细胞的比例显著降低(p＜0.01)。
　　四、甲烷饱和盐水显著降低慢性炎性痛大鼠脊髓背角氧化应激水平
　　与假手术组相比，MA组大鼠脊髓SOD、CAT活性降低，氧化应激产物MDA和8OHDG表达上调(p＜0.01)。而甲烷饱和盐水连续给药可以部分恢复MA诱导的脊髓背角SOD和CAT的活性(p＜0.05)。同时，与生理盐水组相比，甲烷饱和盐水处理组脊髓背角氧化产物MDA和细胞内氧化应激产物8OHDG的表达下调(p＜0.05)。
　　五、甲烷饱和盐水能够降低慢性炎性痛大鼠脊髓炎性介质表达水平
　　与假手术组相比，MA组大鼠术侧脊髓背角中促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α)表达上调，抑炎细胞因子IL-10表达下调(p＜0.05)。而甲烷饱和盐水连续给药后可以抑制模型大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α的过表达，同时促进IL-10的表达(p＜0.05)。
　　研究结论:
　　在CFA诱导的单关节炎慢性疼痛模型大鼠中，腹腔注射甲烷饱和盐水能显著提高模型大鼠PWT，同时抑制脊髓胶质细胞活化、减少外周T细胞脊髓浸润数量，下调氧化应激产物及促炎细胞因子的表达，保护抗氧化能力及上调抑炎细胞因子的表达，最终减轻大鼠的慢性炎性痛。本研究提示，甲烷饱和盐水可能通过抗氧化应激和抗神经炎症作用影响模型大鼠痛行为学变化，发挥镇痛效应，甲烷饱和盐水可能成为慢性炎性痛新的治疗选择。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 甲烷饱和盐水对慢性炎性痛大鼠机械性触诱发痛的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 甲烷饱和盐水对脊髓胶质细胞及外周T细胞浸润的调控作用

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 抗氧化及抗炎作用参与甲烷饱和盐水的镇痛效应

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 氧化应激参与病理性疼痛的作用机制的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢