Activin A、依沙吖啶及3D培养联合诱导骨髓间充质干细胞向甲状腺滤泡细胞分化

摘要

目的： 甲状腺功能减退症是由于甲状腺激素合成和分泌减少或组织利用不足导致的全身代谢减低综合征。典型临床表现以代谢率减低和交感神经兴奋性下降为主。临床治疗主要以外源性激素药物左旋甲状腺素片为主，偶有甲状腺自体或异体移植手术作为替代治疗。药物治疗需要终生服用且剂量影响因素较多需要终生随访调整，过量服用或者摄入不足都会引起严重的临床表现。外科移植治疗局限性明显，治疗效果不确切。 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体，对其的研究广泛。据报道，胚胎干细胞可以通过药物刺激具有PDZ结合基序的共激活转录因子TAZ的高表达来促进向甲状腺滤泡细胞的诱导分化，因为TAZ可以共激活调节甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1的转录，从而促进胚胎干细胞向甲状腺滤泡细胞方向分化，但胚胎干细胞具有伦理方面的限制。 3D培养技术能够为细胞培养提供与生物体内状态相似的立体微环境，克服平面2D培养细胞间粘附、机械力传导及效应因子运输等方面的不足，在干细胞研究领域特别是组织工程方面优势明显。 所以本课题选择无伦理限制的骨髓间充质干细胞（Bonemarrow messenchymal stem cells,BMSCs）作为细胞来源，通过激活素A联合依沙吖啶（TAZ代表性药物）的药物共诱导及3D培养技术的方法，来研究以下两个问题：①激活素A和依沙吖啶对SD大鼠BMSCs向甲状腺滤泡细胞分化的诱导作用。②3D培养技术对SD大鼠BMSCs向甲状腺滤泡细胞分化的诱导作用。 方法： 1、BMSCs的获得：取体重150g雄性SD大鼠4只，利用全骨髓贴壁法获得原代骨髓间充质干细胞。取P3代BMSCs接种六孔板培养待用。 2、激活素A诱导培养细胞：选取P3代SD大鼠BMSCs悬液以1x105个/ml接种六孔板培养，待每孔细胞生长融合至80%时加入含不同浓度Activin A的培养基诱导培养1周，隔天换液。激活素A按浓度分组：25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml。通过观察细胞形态及生长状态、检测内胚层标志物SOX17、FOXA及甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1表达，来观察激活素A是否适合BMSCs的培养及其促进BMSCs向内胚层转化的最适浓度。 3、激活素A联合依沙吖啶的培养： 按照激活素A最适浓度培养4天后改用依沙吖啶培养21天的原则，各组按依沙吖啶浓度不同分组如下，： ①.正常对照组、 ②.激活素A（100ng/ml）组、 ③.激活素A（100ng/ml）+依沙吖啶（0.1μM）组、 ④.激活素A（100ng/ml）+依沙吖啶（1μM）组、 ⑤.激活素A（100ng/ml）+依沙吖啶（5μM）组、 通过对细胞形态观察及甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1及TAZ的表达、培养基中甲状腺功能指标的检测以及相关免疫荧光检测，研究激活素A联合依沙吖啶对SD大鼠BMSCs向甲状腺滤泡细胞分化的作用。 4、3D培养：取激活素A联合依沙吖啶诱导培养后甲状腺滤泡样细胞，按On-top法、Embedded法分别接种于Matrigel基底膜基质胶内培养7天；对照组接种细胞于24孔板内，无Matrigel基底膜机制胶涂覆。通过观察基质胶内细胞形态、甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1的表达，研究3D培养技术对BMSCs向甲状腺滤泡样细胞分化的作用。 结果： 1、激活素A培养：诱导后BMSCs形态呈梭形，生长状态良好，不同浓度激活素A实验组与正常对照组比较无明显差异。不同浓度组激活素A均可刺激内胚层标志物SOX17、FOXA2的表达增高（P＜0.05）。不同浓度组激活素A均可刺激甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1表达增高，其中100ng/ml组增高最明显（P＜0.05）。 2、激活素A（100ng/ml）联合依沙吖啶培养：0.1μM组细胞生长密集，边界清晰，形态呈梭形，胞质颜色呈深绿色；甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1及TAZ的表达较正常对照组、激活素A（100ng/ml）单独培养4天组均明显增高（P＜0.05）。其中激活素A（100ng/ml）+依沙吖啶（1.0μM）组表达最高（P＜0.05），该组细胞免疫荧光检测发现Pax8、Nkx2-1、TAZ在细胞核内显示，对照组未见显示；NIS、TPO、TSHr在细胞膜内显示，对照组未见显示；TG在实验组和对照组间均未见显示。 3、培养基中甲状腺功能指标T3、T4、TSH检测，实验组培养1周、2周、3周组与对照组比较，均未发现有显著改变（P＞0.05）。 4、3D培养方法On-top法较Embedded法培养1周后细胞生长状态良好，细胞呈梭形，细胞接触更多、细胞间连接紧密。实验组3D培养法对甲状腺标志性转录因子Pax8、Nkx2-1的表达较对照组显著增高（P＜0.05）,而On-top法与Embedded法两组间比较无统计学差异（P＞0.05）。 结论： 1、激活素A联合依沙吖啶可以促进SD大鼠BMSCs向甲状腺滤泡细胞方向分化，但未见TG分泌。其中以激活素A（100ng/ml）培养4天+依沙吖啶（0.1μM）培养21天培养分化效果最好。 2、基于Matrigel基底膜基质的3D培养方法适合SD大鼠BMSCs的增殖分化培养，其中以On-top法培养效果最好。

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