一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基

摘要

本发明提供了一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基，本发明诱导培养基组成为：地塞米松1×10-8mol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠10mmol/L，溶剂为骨片完全培养基的上清液，其成分为：胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，DMEM培养液和F12培养液的混合物以及骨片培养过程中骨细胞分泌的多种生长因子。本发明通过更换细胞培养液和细胞贴壁传代的方法纯化小鼠骨髓间充质干细胞，取获得的第1代细胞进行诱导，以培养72-96小时的骨片完全培养基的上清液为成骨细胞分化诱导剂的溶剂，明显提高了骨髓间充质干细胞的体外成骨分化效率。

说明书

技术领域

本发明涉及骨髓间充质干细胞的体外成骨细胞诱导分化方法，以及所用的诱导培养基。

背景技术

骨髓间充质干细胞在适当的条件刺激下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞类型，而且易于分离培养，具有较强的自我更新、分化能力和免疫抑制等优点，使其在组织器官缺损性疾病、组织器官退行性疾病以及细胞治疗和组织工程领域具有重要的应用前景。近来有众多的国内外研究探索骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的方法，以期作为骨组织工程的研究基础和临床骨相关疾病生物治疗的理论指导。体外分离纯化的骨髓间充质干细胞经过传代后，相关的生物学特性发生改变，外形未见明显变化，但是已逐渐失去其分化潜能，经过定向诱导分化后只有少量的细胞向所需的方向分化，影响其作为组织工程细胞来源的应用。近来有研究报道将一些与成骨细胞分化相关的细胞因子应用于干细胞成骨分化相关的研究中，对提高骨髓间充质干细胞的成骨分化效率具有一定的生物学效应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，能提高分化效率。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，所述方法包括：

（一）骨髓间充质干细胞的体外分离、培养和纯化 

 取骨髓细胞，经筛网过滤后制成单细胞悬液接种于培养皿中进行贴壁培养，初始接种密度为5×10⁶个/mL细胞培养基，培养3小时后更换细胞培养基（组成同前），此后每隔12小时更换一次细胞培养基（组成同前），直到接种后72小时，然后再每隔3天更换细胞培养基（组成同前）继续培养，直到细胞长至80%~90%融合，以胰酶消化，消化时间不超过2分钟，细胞传代后继续培养或直接接种于孔板中用于诱导向成骨细胞分化；所述细胞完全培养基终浓度组成如下：胎牛血清10%（体积百分比浓度），青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比为1:1的混合物。

（二） 骨贴片培养和培养基上清的获取、保存

采用无菌的显微钳将已经取出骨髓内容物的小鼠股骨和胫骨分成约4mm²大小的骨片，均匀放置于培养皿中，骨髓腔面接触培养皿底，置于37℃、饱和湿度、含5% CO₂的培养箱中进行骨片培养，待培养至72~96小时有大量细胞从骨片爬出时收集其上清液，离心后冻存于－20℃。所述骨片完全培养液终浓度组成如下：胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比1:1的混合液。

（三） 骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化

原代接种的第1代骨髓间充质干细胞长至80％~90％融合时，添加0.25%胰酶（含有0.02%EDTA）室温消化细胞2分钟，添加完全培养基终止消化后经过离心分离获得细胞沉淀，然后以相同的密度分接种于12孔板中，待细胞扩增至80％融合后添加诱导培养基进行诱导分化。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种用于骨髓间充质干细胞的体外诱导向成骨分化的诱导培养基，所述诱导培养基的终浓度如下：地塞米松1×10^-8 mol/L，抗坏血酸50μmol/L，甘油磷酸钠10 mmol/L，溶剂为所述骨片培养72～96小时的上清液。

优选的，所述诱导培养基终浓度组成如下：地塞米松1×10^-8 mol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，溶剂为所述骨片培养72小时的上清液，所述上清液为骨片完全培养液以及在骨片培养过程中骨细胞分泌的多种细胞因子。

本发明在以往的研究基础上，采用骨片培养上清液和成骨诱导培养基结合的方法，取传代后的第1代骨髓间充质干细胞进行成骨细胞分化，明显提高了骨髓间充质干细胞的成骨分化效率。

本发明的骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，具有如下优点：

（1）早期诱导可充分体现骨髓间充质干细胞的分化能力。

（2）骨片培养过程中释放到培养液中的多种细胞因子不仅有利于骨髓间充质干细胞的存活，还有利于纯化的骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。

（3）骨片培养上清液来源方便，获取方法简单可行。

附图说明

图1 为实施例1的成骨细胞分化染色结果图。

图2 为实施例2的成骨细胞分化染色结果图。

图3 为实施例3的成骨细胞分化染色结果图。

图4为骨片培养至72小时的细胞爬片图。

其中，图中箭头所示为钙结节沉淀，红色为钙化物沉淀，图片的放大倍率均为100倍。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

所用试剂：胎牛血清（Hyclone），青霉素、链霉素、DMEM培养液、F12培养液（Gibco），地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠、5’－氮胞苷（Sigma）。

1、取6周左右的ICR雄性成年小鼠（购买于浙江省医学科学院实验动物中心），颈椎脱臼处死，无菌条件下取出股骨和胫骨。

2、无菌剪刀剪开两端骨骺，用注射器吸取完全培养基冲洗骨髓腔，完全培养基组份：10%（v/v）胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为DMEM/F12培养液（即DMEM与F12体积比1:1的混合液）。

3、获得的骨髓细胞悬液经200目筛网过滤，接种于10 cm的培养皿中，初始接种密度约为5×10⁶个/mL，细胞培养基为完全培养基，初始接种的细胞培养基体积为2mL，可覆盖培养皿底。

4、初始接种的骨髓细胞置于37℃、饱和湿度、含5% CO₂的培养箱中培养3小时后更换细胞培养基，体积为2 mL。

5、初次更换培养基12小时后，再次更换细胞培养基，体积仍为2 mL，12小时后，再次更换细胞培养基，至初次接种后72小时，更换细胞培养基体积增加为8 mL，之后每3天更换一次细胞培养基，体积为8 mL，待细胞长至80%融合时进行消化传代接种于12孔板中，在倒置显微镜下观察培养不同时间的细胞形态。

6、收集骨髓细胞的同时，用显微钳将已经取出骨髓内容物的股骨和胫骨用分为约4mm²的骨片，骨髓腔面向下均匀放置于30mm的培养皿中，每只小鼠的骨片放置于同一个培养皿中培养，每个培养皿中添加的完全培养液体积为2mL，置于37℃、饱和湿度、含5% CO₂的培养箱中培养72小时，骨片周围有大量细胞爬出时（如图4所示），吸取上清液至离心管中，10000转/分钟离心5分钟，收集上清液，冻存于－20℃备用（收集的上清液即为步骤6中成骨诱导分化所用的骨片培养上清液）。

7、细成骨诱导分化：接种于12孔板中的第1代细胞长至80%融合时，PBS缓冲液洗涤细胞三次后，添加0.25%（w/v）胰酶（含有0.02%（w/v）EDTA）室温消化细胞2 min，细胞完全培养基终止消化，细胞悬液经300g离心5 min后，完全培养基悬浮细胞接种于12孔板中继续培养，待细胞长至80％融合时，更换为骨片培养上清液，添加地塞米松1×10^-8 mol/L、抗坏血酸50μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L后进行成骨诱导分化，每3天更换一次诱导培养基，分化21天后采用茜素红S染色检测小鼠骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化结果，所述诱导培养基的终浓度组成为：地塞米松1×10-8 mol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，溶剂为培养72小时的骨片培养上清液。

实施例2：

本实施例步骤7中进行诱导分化的的骨髓间充质干细胞是通过细胞贴壁培养和胰酶消化传至第3代的细胞，本实施例的其他步骤与实施例1相同。

实施例3：

本实施例中的诱导培养基的成分是细胞完全培养基添加与实施例1中相同浓度的地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。

骨髓间充质干细胞的成骨细胞诱导分化结果鉴定：

实施例1和实施例2、3中的小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化21天后，PBS洗涤细胞，4％多聚甲醛固定30分钟，蒸馏水洗涤3遍，0.2％的茜素红S室温染色30分钟，然后弃去染色液，蒸馏水洗涤3遍，显微镜下观察小鼠骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化结果。

结果如附图，图1为实施例1的成骨分化细胞茜素红S染色结果显示细胞密度较高，视野中几乎所有的细胞均染成红色，且有众多的钙化物和钙结节沉淀（图1所示），分化效果明显；实施例2采用传至第3代的细胞进行成骨诱导分化，只有少量的钙结节形成，而且细胞已经失去原来的形态，变得宽大扁平，细胞界限模糊（图2所示）；实施例3采用细胞完全培养基添加诱导剂各成分对第1代细胞进行成骨诱导，经过21天的诱导后，细胞密度相对较低，有钙化物和钙结节沉淀形成（图3所示），显然实施例1中的分化效果好，分化效率明显提高。