7，12-二甲基苯蒽（DMBA）体外诱导山羊乳腺上皮细胞的转化

摘要

本试验对山羊乳腺组织细胞的分离及原代培养方法进行了改进，并对乳腺上皮细胞的一些生长特性作了总结；在此基础上，以7,12-二甲基苯蒽(DMBA)为致癌剂，佛波酯(TPA)为促癌剂，探索了乳腺上皮细胞体外两步法转化的过程，摸索了改良Feulgen染色的程序，为进一步利用ICM(显微图像分析仪)对转化过程中核DNA含量的变化进行实时监测奠定基础，结果如下：1.用组织块培养法和消化法均可获得良好的山羊乳腺细胞原代培养物；培养的山羊乳腺成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感，混合培养物用0.15﹪胰蛋白酶与0.02﹪EDTA消化液在37℃控时消化，先脱落下来的主要为成纤维细胞，经过2～3代传代筛选培养，即可得到纯化的乳腺上皮细胞。2.用添加10﹪DMSO和10﹪胎牛血清的DMEM/F12为冻存液，按直径不同将山羊乳腺组织块分成3组：小于0.3mm，0.3～0.5mm和0.5～1.0mm，并适当延长体外平衡时间进行冷冻保存。结果表明：以直径＜0.3mm，每管不超过6块为佳，采用室温平衡6h后分两次梯度添加DMSO至10﹪，于0℃平衡1h，-20℃平衡2h，直接投入到液氮中的冻存效果较好。3.用DMEM/F12体外培养山羊乳腺上皮细胞，传至第9代时其生长仍正常。多数上皮细胞呈短梭形或多角形，呈蜂窝状；部分细胞呈圆饼状，体积较大。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对细胞上清液中的蛋白质进行分离，其中有3个条带与标准蛋白的3个条带一致，表明山羊乳腺上皮细胞在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。4.以含5ug/mL、10ug/mL、15ug/mLDMBA的完全培养液对组织块和消化法得到的细胞分别进行36h，24h和12h处理后，施以25ng/mLTPA作用2周，结果显示，15ug/mLDMBA作用12h组细胞基本死亡，5ug/mLDMBA36h组细胞转化效果最佳；转化细胞的初期形态学表现为：细胞增大，扁平；随后细胞核浓缩，细胞整体变小；接着细胞排列紊乱，出现无规则生长；最后出现转化灶。5.应用改良Feulgen染色法定量监测转化过程中细胞核DNA的变化，以95﹪乙醇固定15min，8mol/mL盐酸水解10min，Schiff液作用20min，其染色效果较佳；对培养在塑料皿中的单层细胞直接染色时，最后的二甲苯透明和树胶封片两步要删除，以免影响最终的染色效果。

目录

文摘

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文献综述第一章动物乳腺细胞培养及体外化学物致癌的研究进展

1.1动物细胞培养研究进展

1.1.1动物细胞培养的发展简史

1.1.2细胞系的生长特点

1.1.3细胞增殖周期

1.2乳腺细胞体外培养的研究进展

1.2.1乳房的结构

1.2.2乳腺细胞培养研究概况

1.2.3培养方法的研究

1.2.4乳腺上皮细胞的类型及其相关性

1.2.5建立乳腺细胞系的研究

1.3体外化学物的研究现状

1.3.1化学致癌物

1.3.2化学物致癌的机理

1.4癌发生过程的研究

1.4.1体内癌的形成

1.4.2体外模拟细胞癌变的过程

1.4.3结语

实验研究第二章山羊乳腺上皮细胞的分离和培养

2.1材料与方法

2.1.1主要材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1原代培养

2.2.2山羊乳腺上皮细胞传代及其纯化培养

2.2.3山羊乳腺组织块冷冻保存

2.2.4山羊乳腺上皮细胞表达蛋白的检测

2.3讨论

2.3.1原代培养方法及酶的选择

2.3.2细胞系的纯化

2.3.3乳腺组织块体外冷冻保存

2.3.4乳腺上皮细胞的分泌功能

2.4小结

实验研究第三章山羊乳腺上皮细胞体外转化的研究

3.1材料与方法

3.1.1主要材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1转化细胞的形态学观察

3.2.2 DMBA的浓度对消化法细胞存活的影响

3.2.3 DMSO对细胞生长的影响

3.2.4 DMBA的浓度对组织块培养法转化过程的影响

3.2.5核DNA染色定量技术

3.3讨论

3.3.1致癌物浓度与转化效率

3.3.2 DMSO的细胞毒作用

3.3.3改良Feulgen染色过程中的注意事项

3.3.4细胞核DNA含量测定与体外转化相关性分析

3.4小结

附图

参考文献

致谢

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