番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）实时荧光PCR检测技术

摘要

番茄细菌性溃疡病(Cmm)是严重危害番茄的细菌性病害，主要靠带菌种子进行远距离传播，被许多国家列为检疫病害。在口岸检疫及种子种苗健康检测中，传统的分离培养、生理生化鉴定、噬菌体检测、免疫荧光染色及寄主致病性试验等是研究者一直采用的方法。这些检验方法存在很多局限性，不适合口岸检疫快速验放的要求。因此，快速、灵敏、特异性强的PCR技术近年来被广泛应用于植物病原菌的检测。但常规PCR技术需很多后续处理，也容易造成实验室及PCR产物的污染。TaqMan实时荧光PCR技术是在普通PCR基础上加入一条TaqMan探针，该探针能在PCR的每个循环与靶序列进行特异性杂交，有效提高反应特异性和灵敏度，更好地避免假阴性结果，使PCR技术检测痕量样品的能力进一步加强。　　本研究依据番茄细菌性溃疡病菌ITS序列的多态性设计TaqMan探针及特异性引物，分别对该病菌进行常规PCR及实时荧光PCR检测。特异性引物及TaqMan探针能检测出所有供试的Cmm菌，其它对照菌均无电泳条带也未收集到荧光信号，显示出该引物-探针组合有很强的特异性。通过对不同浓度菌悬液的常规PCR和实时荧光PCR扩增，发现实时荧光PCR检测灵敏度比常规PCR高约100倍，能很好地避免假阴性结果。以接种但未显示症状的番茄苗叶片提取核酸作为模板，常规PCR方法能在接种后第6天检测到该菌，而实时荧光PCR则可以在接种后第4天就检测到该菌的存在。通过对人工模拟带菌种子的测试发现，番茄种子的核酸作为模板对PCR扩增不存在抑制作用或抑制作用微弱，完全可以通过实时荧光PCR技术获得准确的试验结果。将带菌种子浸泡液及带菌种子的核酸作为模板进行PCR扩增，实时荧光PCR的相对灵敏度明显高于常规PCR，而且经过比较得出，应用种子核酸作为模板能到达更好的检测效果。本研究可直接应用植物总DNA作为试验材料，无需进行病原菌的分离培养及性状观察。由于采用光电传导系统和计算机操作系统能够很直观地反映出整个PCR过程各个反应阶段的信息，而且不需要进行PCR产物的后续处理，可以提高检测效率，减少污染。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1番茄细菌性溃疡病菌的概述

1.2番茄溃疡病菌的检测方法

1.2.1寄主植物接种检测

1.2.2 血清学方法检测

1.2.3脂肪酸甲酯分析

1.2.4噬菌体定型法

1.3植物病原细菌分子检测新技术

1.3.1分子杂交检测法

1.3.2经典PCR技术在植物病原细菌检测中的应用

1.3.3 PCR技术在植物病原细菌检测中的新突破

1.3.4杂交检测的新进展

1.4实时荧光PCR检测技术

1.4.1 TaqMan探针

1.4.2 Amplisensor探针

1.4.3分子信标

1.4.4杂交双探针

1.5本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1供试菌株

2.2仪器和试剂

2.3植物材料

2.4培养基及溶液的配制

2.5核酸制备

2.5.1细菌核酸提取

2.5.2番茄叶片的核酸提取

2.5.3种子核酸的提取

2.6接种及带菌种子的制备

2.7番茄细菌性溃疡病菌16S-23S rDNA基因普通PCR扩增

2.7.1引物的设计

2.7.2反应体系及扩增条件

2.7.3 PCR产物电泳分析

2.7.4 PCR产物的克隆和转化

2.7.5大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.7.6克隆的筛选

2.7.7质粒的提取和酶切

2.8番茄细菌性溃疡病菌实时荧光PCR检测方法的建立

2.8.1 TaqMan探针与引物的设计合成

2.8.2实时荧光PCR检测

第三章结果与分析

3.1 PCR产物的克隆及序列测定

3.2常规PCR的特异性检测

3.3实时荧光PCR的特异性检测

3.4实时荧光PCR与常规PCR的相对灵敏度比较

3.5常规PCR及实时荧光PCR对未显症接种苗的检测

3.6常规PCR及实时荧光PCR对模拟染菌种子的检测

3.6.1以模拟带菌种子的浸泡液为模板进行常规及实时荧光PCR检测

3.6.2以模拟带菌种子的核酸为模板进行常规及实时荧光PCR检测

第四章小结与讨论

4.1重要结论

4.2目的基因的选取

4.3核酸的提取、纯化及抑制物质的去除

4.4 PCR反应条件的优化

参考文献

致谢

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