番茄细菌性溃疡病菌血清学、PCR检测技术及其遗传多样性的研究

摘要

本文针对番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter'reichiganensis subsp.michiganensis，简称Cmm)的血清学、PCR检测方法和该病菌的遗传多样性做了了研究，主要研究结果如下： 用Cmm的菌体蛋白免疫家兔制备出该病菌的特异性抗血清，琼脂双向扩散法测定其效价为1:80。该抗血清经饱和硫酸铵沉淀、盐析、葡聚糖凝胶过滤层析纯化后能检测出Cmm的样品，而不与Clavibacter。michiganense subsp.Sepedonicum、Clavibactermichiganense subsp.insidiosum发生反应。通过与Agdia公司研制的Cmm的ELISA试剂盒比较，证明该研究的间接ELISA法检测特异性比ELISA试剂盒要高，时间更短，灵敏度相同，可应用于田间检测或室内检测。 用常规PCR方法和实时荧光PCR方法分别检测Cmm菌悬液和田间采集的病组织，结果表明，常规PCR方法检测灵敏度为105cfu/mL；TaqMan探针实时荧光PCR方法检测检测灵敏度为103-4cfu/mL,比传统PCR方法检测灵敏度(105cfu/mL)提高10-100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色和Southern杂交。 用Rep-PCR法分析收集的33个番茄溃疡病菌菌株，结果表明，用BOX引物分别扩增出8-15条多态性条带，分子量大小200-3000bp，大多数主要集中在500-2800bp之间；指纹图谱分析结果为：在遗传距离为0.18时，测试的33个菌株可划分为I组群、II组群、Ⅲ组群、IV组群、V组群、VI组群和VII组群7个遗传相似组群，其中VI组群包含的菌株最多，表明我国番茄细菌性溃疡病菌菌株具有丰富的DNA多态性和较大的遗传变异，同时明番茄溃疡病菌的遗传分群与菌株的地理来源有一定相关性，但与该病在发病的年份几乎无差别。

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第一章文献综述

1番茄细菌性溃疡病及病原菌

1.1病害分布

1.2症状特点

1.3病原生物学

1.4分类地位

1.5寄主植物

1.6病原菌的传播及病害流行

1.7病原菌的存活及侵染循环

1.8番茄细菌性溃疡病的防治

2番茄溃疡病的研究现状

2.1国内研究现状

2.2国外研究现状

3番茄细菌性溃疡病菌的检测方法

3.1田间观察

3.2病原分离培养鉴定

3.3在番茄和烟草上的致病性测定

3.4紫茉莉接种检测

3.5血清学方法检测

3.6脂肪酸甲酷分析

3.7噬菌体定型法

4植物病原细菌分子生物学检测技术研究进展

4.1基因组指纹技术在植物病原细菌群体多样性研究中的应用

4.2植物病原细菌DNA分子检测技术

4.3实时荧光PCR技术及应用

4.4杂交检测的新进展

5本研究的目的和意义

5.1研究目的

5.2研究意义

第二章番茄细菌性溃疡病菌血清学的研究与应用

1实验材料

1.1菌株

1.2试剂

1.3仪器及耗材

2抗血清的制备

2.1实验动物

2.2免疫抗原的制备

2.3佐剂抗原的制备

2.4免疫注射与抗血清的提取

2.5抗血清效价的测定

2.6抗血清中免疫球蛋白(IgG)的提取与纯化

2.7抗血清的特异性测定

3结果与分析

3.1自制抗血清的效价测定

3.2自制抗血清的特异性

3.3间接ELISA法的检测稳定性

3.4间接ELISA法的检测灵敏度

4小结与讨论

第三章番茄细菌性溃疡病菌的PCR检测方法的研究

1材料与方法

1.1供试材料

1.2仪器及试剂

1.3菌株的培养保存与菌悬液配制及病组织的预处理

1.4常规PCR检测

1.5 TaqMAN探针实时荧光PCR检测

2结果与分析

2.1常规PCR检测

2.2常规PCR检测的特异性

2.3 TaqMAN探针实时荧光PCR检测

2.4 TaqMAN探针实时荧光PCR检测的特异性

2.5常规PCR方法与实时荧光PCR方法检测效果的比较

3小结与讨论

第四章番茄细菌性溃疡病菌的菌系分化的研究

1材料与方法

1.1试验菌株

1.2菌株的培养保存与菌悬液配制及处理

1.3细菌基因组DNA的提取

1.4 ERIC-PCR和BOX-PCR特异性引物

1.5 PCR扩增

1.6对ERIC-PCR和BOX-PCR的两种指纹图谱的聚类分析方法

2结果与分析

2.1番茄细菌性溃疡病菌基因组的ERIC-PCR指纹图谱分析

2.2番茄细菌性溃疡病菌基因组的BOX-PCR指纹图谱分析

2.3 ERIC-PCR与BOX-PCR两种结果的比较分析

3讨论与结论

3.1 Rep-PCR技术可快速区分菌株间的遗传差异

3.2 Rep-PCR技术可用于快速监测番茄细菌性溃疡病菌群体的遗传多样性

3.3番茄细菌性溃疡病菌的遗传分群与菌株的地理来源关系

第五章结论与讨论

1关于自制抗血清和间接法ELISA检测番茄细菌性溃疡病菌

2常规PCR法与实时荧光PCR法检测Cmm效果的比较

3关于REP-PCR在番茄细菌性溃疡病菌遗传多样性上的研究

3.1比较ERIC与BOX两种引物在番茄细菌性溃疡病菌遗传多样性的应用

3.2 BOX引物用于番茄细菌性溃疡病菌群体的遗传多样性分析

3.3番茄细菌性溃疡病菌的遗传分群与菌株的地理来源关系

参考文献

致谢

作者简介

附录