昆白小鼠胚胎干细胞分离克隆及向心肌细胞定向诱导分化的研究

摘要

本研究从昆白小鼠胚胎中分离克隆出小鼠ES细胞，并对其进行了传代培养和鉴定；并以ES-D3为材料，采用不同的诱导物将小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化。对影响小鼠ES细胞分离与克隆及向心肌细胞定向诱导分化的的影响因素进行了探讨，为进一步建立昆白小鼠ES细胞系及建立稳定的心肌细胞诱导体系奠定了基础。实验主要结果如下：　　1.从1678枚昆白小鼠胚胎中分离培养ES细胞，ICM形成率为70﹪(1167/1678)，有3株传至第8代。　　2.分别比较了桑椹胚，早期囊胚，扩张囊胚，孵化囊胚的贴壁率，生长行为和原代集落出现个数。结果表明孵化囊胚是最理想的ICM分离材料。　　3.分别比较了全胚法，免疫外科法，酸处理法，酶消化对ES细胞分离克隆的影响。发现利用全胚法培养孵化囊胚，是一种可行的ICM分离方法，该方法操作简单，且能很好的保持ICM的活力，利于传代。　　4.MEF、STO、HEF及Sertoli在小鼠胚胎贴壁率无显著差异(P＞0.05)；但在原代集落出现率及传代率上4者有明显差异。MEF最好，Sertoli和STO次之，HEF效果最差。　　5.不同培养液对小鼠胚胎贴壁率及ICM集落形成率无明显影响，ES细胞培养液在ES细胞分离传代上明显好于大鼠心肌细胞及肝脏细胞条件培养基(P＜0.05)；大鼠心肌及肝脏条件培养基可用于小鼠ES细胞分离培养；LIF对昆白小鼠ES细胞的分离与克隆具有至关重要的作用。　　6.0.1﹪胶原酶与0.25﹪胰酶+1﹪鸡血清是较好的ES细胞消化液，对细胞损伤力小，且传代后ES细胞集落形成能力也较高(P＜0.05)。0.05﹪胰酶+0.008﹪EDTA也可用于ES细胞传代；0.25﹪胰酶+0.04﹪EDTA对ES细胞的损伤较大，不适于小鼠ES细胞的分离与克隆。　　7.分离得到的小鼠ES细胞，AKP染色阳性。0ct-4，SSEA-1染色阳性。体外可自发分化为上皮样、神经样、成纤维样、表明提外培养的ES细胞具有多能性。　　8.比较了小鼠ES细胞在不同条件下分化为心肌的效率。结果表明单独使用5-氮胞苷或联合使用二甲基亚砜(DMSO)与维甲酸(RA)诱导均可促进ES细胞分化为心肌细胞。其中5-氮胞苷的最佳浓度为15μmol/L，RA的浓度为10-8～10-9mol/L。

目录

文摘

英文文摘

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综述前言

综述第一章胚胎干细胞基本概念及应用前景

1.1 ES细胞的基本特性

1.1.1ES细胞的形态学特征

1.1.2多能性

1.1.3可在体外培养条件下建立稳定的细胞系

1.1.4含正常二倍染色体

1.1.5种系传递功能

1.1.6可以进行遗传操作

1.2哺乳动物胚胎干细胞的研究进展

1.2.1小鼠胚胎干细胞研究进展

1.2.2人类胚胎干细胞研究进展

1.2.3其它胚胎干细胞研究进展

1.2.4胚胎干细胞与胚胎生殖细胞

1.3胚胎干细胞分离和克隆方法

1.3.1延迟着床法

1.3.2全胚培养法

1.3.3 ICM培养法

1.3.4热休克法

1.3.5离散卵裂球

1.3.6克隆法

1.3.7 PGCSs培养法

1.4胚胎干细胞的鉴定方法

1.4.1形态学鉴定

1.4.2细胞表面抗原标志物

1.4.3核型分析

1.4.4体内分化实验

1.4.5体外分化实验

1.4.6嵌合体制备

1.5影响胚胎干细胞分离与克隆的因素

1.5.1遗传因素

1.5.2胚胎日龄

1.5.3培养液

1.5.4分化抑制物

1.5.5添加物

1.5.6传代方法

1.5.7培养系统的稳定状态

1.6动物胚胎干细胞研究意义与应用前景

1.6.1细胞分化研究

1.6.2发育调控基因研究

1.6.3基因动物的研究

1.6.4人类疾病治疗

综述第二章胚胎干细胞定向分化的研究进展

2.1胚胎干细胞诱导分化的一般方法

2.1.1细胞因子诱导法

2.1.2选择性标记基因筛选目的细胞法

2.1.3特异性转录因子异位表达

2.1.4药物及化学试剂诱导法

2.2 ES细胞的分化调控

2.2.1内源性调控

2.2.2外源性调控

2.3胚胎干细胞诱导分化研究概况

2.3.1心肌细胞

2.3.2神经细胞

2.3.3造血细胞

2.3.4血管和内皮细胞

2.3.5其它细胞

2.4 ES细胞与心肌损伤性疾病的治疗

实验研究第三章昆白小鼠胚胎干细胞的分离培养

3.1实验材料

3.1.1实验动物

3.1.2主要试剂及仪器设备

3.2实验方法

3.2.1主要溶液配制

3.2.2饲养层的制备

3.2.3条件培养基的制备

3.2.4胚胎的获得及培养

3.2.5 ES细胞的分离与克隆

3.2.6 ES细胞的鉴定

3.3结果

3.3.1昆明小鼠ES细胞形态学观察

3.3.2胚胎种类对ES细胞分离克隆的影响

3.3.3胚胎处理方法对ES细胞分离克隆的影响

3.3.4饲养层对昆白小鼠ES细胞分离作用的影响

3.3.5培养液对昆白小鼠ES细胞分离的影响

3.3.6传代方法对昆白小鼠ES细胞分离传代的影响

3.3.7昆白小鼠ES细胞的鉴定

3.4讨论

3.4.1品系对分离克隆小鼠ES细胞的影响

3.4.2胚胎日龄及胚胎种类对分离克隆小鼠ES细胞的影响

3.4.3胚胎处理方法对分离克隆小鼠ES细胞的影响

3.4.4饲养层对分离克隆小鼠ES细胞的影响

3.4.5培养基对分离克隆小鼠ES细胞的影响

3.4.6传代方法对昆白小鼠ES细胞分离传代的影响

实验研究第四章胚胎干细胞(ES-D3)向心肌细胞定向诱导分化

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1诱导试剂的配制

4.2.2 ES-D3细胞培养及传代方法

4.2.3 ES-D3细胞向心肌细胞的诱导分化

4.2.4分化的心肌细胞鉴定

4.2.5.心肌细胞刚性率的统计分析

4.3结果与分析

4.3.1形态学观察

4.3.2不同浓度5-氮胞苷对ES细胞向心肌细胞分化的影响

4.3.3不同浓度RA对ES细胞向心肌细胞分化的影响

4.4讨论

结论

参考文献

附图

致谢

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