猪瘟病毒P80基因的真核表达及p80蛋白对PK-15细胞致病变作用的研究

摘要

利用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)技术，从猪瘟病毒株细胞毒中克隆出P80基因，并进一步把P80基因连接在真核表达载体pEGFP-C1上，成功地构建出P80基因重组真核表达质粒(pEGFP-P80)，为在哺乳动物细胞中表达并纯化出p80蛋白奠定了基础。接着，把构建好的重组质粒pEGFP-P80在PK-15细胞中进行表达来研究p80蛋白对PK-15细胞的致病变作用，为研究p80蛋白与猪源细胞发生CPE效应之间的联系进行了探讨。　　1.参考已经发表的猪瘟病毒Alfort株和Brescia株的全基因组序列，设计2对引物P1/P2和B1/B2，在B1和B2的5′端分别引入XhoⅠ和ApaⅠ酶切位点，使用RNA-步提取试剂盒，利用RT-PCR和nPCR技术，成功地从猪瘟Shimen株细胞毒中扩增出约2.0kb大小的P80基因。将PCR产物分离、纯化并与克隆载体pMD18-T连接，然后进行核苷酸序列测定和PCR、BamhⅠ/HindⅢ双酶切的鉴定，结果表明其为P80基因的重组质粒(pMD-P80)。将pMD-P80分别经XhoⅠ和ApaⅠ双酶切和回收，然后与经过XhoⅠ和ApaⅠ酶解的真核表达载体pEGPF-C1连接、转化，获得重组质粒，经PCR，XhoⅠ和ApaⅠ限制性酶切和序列测定，鉴定为真核表达质粒pEGFP-P80，并且目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确，为在哺乳动物细胞中表达并分离纯化p80蛋白奠定了基础。　　2.利用阳性脂质体L2000介导，在六孔细胞培养板中，将已经构建好的pEGFP-P80重组表达质粒转染到PK-15细胞中进行表达。在转染后6h，利用荧光显微镜监测到发出绿色荧光的融合蛋白；在转染后24h，利用免疫组化SABC法检测到目的蛋白p80。结果表明，重组表达质粒pEGFP-P80可以在PK-15细胞中表达出有免疫活性的p80蛋白。重复转染操作，在96孔细胞培养板中，将pEGFP-P80重组表达质粒和空质粒pEGFP-C1分别转染到PK-15细胞中进行表达。分别在转染后24h、48h对转染了pEGFP-P80质粒的细胞组和转染了空质粒pEGFP-C1的细胞组进行MTT比色，测定OD值，并进行两组细胞活性分析。结果表明，利用pEGFP-P80重组表达质粒在PK-15细胞中表达出的p80蛋白未对宿主细胞有明显的致病变作用。

目录

文摘

英文文摘

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文献综述第一章猪瘟及猪瘟病毒研究进展

1.1猪瘟研究进展

1.1.1猪瘟的流行与分布

1.1.2猪瘟的临床症状

1.1.3猪瘟的诊断

1.1.4猪瘟病毒粒子结构、形态及理化特性

1.1.5 CSFV的侵入及其在宿主体内的分布

1.1.6 CSFV在宿主细胞中的繁殖过程

1.2猪瘟病毒分子生物学研究进展

1.2.1 CSFV的基因组结构和全序列研究概述

1.3 CSFV基因组编码的蛋白质及其功能

1.3.1猪瘟病毒的结构蛋白及其功能

1.3.2非结构蛋白及功能

1.4 CSFV基因组内部的缺失、重组与感染CSFV细胞出现CPE的关系

1.5 NS3基因在病毒的复制及病毒与宿主细胞关系中的作用

1.6猪瘟病毒的分子免疫学研究进展

1.6.1囊膜结构糖蛋白E2和E0是CSFV的主要保护性抗原

1.6.2猪瘟的防制策略与防制新技术的研究

第二章猪瘟Shimen株P80基因真核表达载体的构建

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要工具酶和试剂及各种细胞培养基

2.1.3主要仪器与设备

2.1.4 DNA操作中其他主要试剂

2.2方法与步骤

2.2.1目的片段的扩增与回收

2.2.2目的基因的克隆

2.2.3重组质粒的提取与鉴定

2.2.4重组表达载体的构建与鉴定

2.3结果

2.3.1 RT-PCR产物的电泳结果

2.3.2目的片段的克隆与鉴定

2.3.3重组表达质粒的鉴定

2.4讨论

2.4.1 P80基因的高度保守性

2.4.2 RNase的存在与否及引物的设计是RT-PCR成败的关键

2.4.3 nPCR可增强反应的特异性和敏感性

2.4.4 哺乳动物细胞表达质粒PEGFP-C1为本实验真核表达载体的优点

2.5小结

第三章P80基因在PK-15细胞中的表达及p80蛋白对PK-15细胞致病变作用的研究

3.1材料

3.1.1质粒与细胞

3.1.2试剂

3.1.3仪器与设备

3.1.4 DNA操作中其他有关主要试剂

3.2方法与步骤

3.2.1质粒的克隆

3.2.2 P80基因在PK-15细胞中的表达

3.2.3表达蛋白的检测

3.2.4 p80蛋白对宿主细胞PK-15的致病变作用研究

3.3结果

3.3.1表达质粒表达产物的荧光鉴定

3.3.2 P80蛋白的SABC免疫组化染色结果

3.3.3 p80蛋白对PK-15细胞致病变作用的检测

4.讨论

4.1影响脂质体介导的基因转染效率的因素

4.1.1预实验找出阳性脂质体与DNA的最佳用量比例

4.1.2细胞的状态

4.1.3血清

4.2免疫组化SABC法检测目的蛋白

4.3 p80蛋白对PK-15细胞的致病变作用

5.小结

结论

参考文献

致谢

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