穿梭表达载体pYG43的构建及在生物素合成酶基因表达中的初步应用

摘要

枯草芽孢杆菌安全无内毒素，遗传背景清晰，分泌能力强，胞外蛋白分离纯化简易，是研究基因表达和蛋白分泌机制的良好系统。本研究以枯草杆菌为表达系统，克隆和筛选了多个启动子，选用效率较高的P43启动子构建了一个大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达载体，并用碱性纤维素酶基因检测了该载体的表达功能，最后将该载体初步应用于生物素合成酶基因表达研究。1.本研究利用蜡样芽孢杆菌基因文库资源，通过鸟枪法和蓝白斑筛选，获得了57个蜡样芽孢杆菌启动子阳性克隆。其中4个启动子(C1，C2，C4和C5)在大肠杆菌中均能有效起始转录，产生的β-半乳糖苷酶(BgaB)活性较高，分别为1229U，780U，1136U和1522U，并不同程度的受葡萄糖抑制。在枯草杆菌中，只有C1和C4表现BgaB酶活(169U和1370U)。序列分析，发现这4个克隆序列具有完整的启动元件和核糖体结合序列，以及潜在的葡萄抑制位点。2.本研究通过PCR技术，获取了启动子P43以及启动子Pamy，并应用β-半乳糖苷酶基因(bgaB)检测了它们的表达能力。P43在枯草杆菌和大肠杆菌中转录活性相似，其活性在对数前期开始显现，然后随着菌量增长迅速提高，稳定期内逐步平稳，稳定期后期随着菌群衰退酶活下降，最高可达9200U；并且P43的活性还受营养条件影响。Pamy转录活性较低，淀粉诱导条件下酶活为1000U；其他条件下酶活接近宿主菌。3.本研究选用枯草杆菌启动子P43，构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达载体pYG43，并运用枯草杆菌带有自身信号肽序列的碱性纤维素酶基因，检测了该载体的表达能力。结果显示碱性纤维素酶在胞外酶活最高可达60U/ml，在原宿主菌(B.subtilis1A747)基础上提高了5～7倍。该载体在枯草杆菌中复制稳定，转录期早于胞外蛋白酶分泌高峰，表达效率高。4.载体pYG43在生物素合成酶基因(bioB)表达的初步应用中，可使生物素产量提高到200mg/L左右，进一步证实了载体pYG43的高效性和初步揭示了生物素合成酶对生物素合成的影响。

目录

文摘

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文献综述 第一章枯草杆菌表达系统研究进展

1启动子系统

1.1 sigma(σ)因子

1.2启动子研究进展

2蛋白分泌系统

2.1信号肽

2.2 Sec途径蛋白质分泌机制

2.3 Tat装置

2.4影响分泌调控和异源蛋白分泌的因素

3载体系统

3.1质粒系统

3.2质粒复制模式和稳定性

3.3染色体整合系统

3.4整合系统的应用

4小结和展望

文献综述 第二章生物素生物合成的研究进展

1生物素的生理功能

2生物素操纵元结构和调控基因

3生物素的生物合成

4生物素合成酶(BioB)在生物素生化合成中的作用

5小节和展望

试验部分 第三章启动子克隆和筛选

第一节蜡样芽孢杆菌启动子片段克隆和转录活性分析

1材料与方法

2结果

3讨论

第二节枯草杆菌启动子P43和Pamy克隆及转录活性分析

1材料和方法

2结果

3讨论

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 PCR结果

2.2载体鉴定

2.3碱性纤维素酶的分泌表达

3讨论

3.1穿梭表达载体pYG43的构建

3.2碱性纤维素酶信号肽序列分析

3.3碱性纤维素酶分泌表达

试验部分 第五章载体pYG43在枯草杆菌生物素合成酶基因表达中的初步应用

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1载体鉴定

2.2生物素合成量检测

3讨论

结论

参考文献

附录一主要试剂和溶液配制

附录二分子生物学常规操作方法

附录三蛋白质SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

致谢

作者简介