羊干酪样淋巴结炎PCR诊断方法的建立及其比较研究

摘要

绵羊和山羊干酪样淋巴结炎(caseouslymphadenitisinsheepandgoat，简称CLA)也称绵羊和山羊伪结核病(pseudotuberculosisinsheepandgoat)，是由伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)引起的一种人畜共患的慢性传染病。伪结核棒状杆菌能使绵羊、山羊、羊驼、骆驼、马、牛等多种动物致病，发病特征是受害动物的淋巴结肿大，呈脓性干酪性坏死；有的在肺、肝、脾和子宫角发生大小不等的结节，内含淡黄色干酪样物质。病羊消瘦，生产性能下降，患病孕羊产出死胎，严重者死亡。由于该病发病缓慢，致死率低，以前常被人们忽视。但由于近年来发病区域的增大以及对畜牧养殖业的严重影响，而且发病后用各种治疗方法效果也不佳，所以现在各个国家都对该病的预防、治疗以及检疫都逐渐重视起来。 该试验分别从2只疑似病羊的肩前淋巴结脓肿内分离了2株菌，记为菌株A、菌株B，经分离鉴定为伪结核棒状杆菌。但分离株与参考菌株(ATCC19410株)在生化特性方面还存在一定的差异。 将参考菌株(ATCC19410株)制成外毒素抗原，同时用参考菌株制成灭活苗，免疫山羊，采集其血液，分离血清，即为阳性血清。将临床健康和菌体凝集抑制试验阴性羊的剖腹产胎儿的血清作为阴性血清。通过ELISA酶标抗体和阳性血清最适浓度的选择、外毒素抗原和阳性血清最适浓度的选择试验，选用适当的抗原、抗体、酶标抗体浓度，设立空白孔、阳性孔、阴性孔做待检血清的ELISA试验，得出阳性判定值。以此建立CLA的ELISA诊断方法，用该方法检测46份待检羊血清，检测到阳性羊2只，阳性检出率为4.35％，这与菌体凝集抑制试验得到的结果相同。 参照已知的伪结核棒状杆菌16SrRNA序列，设计合成了1对引物，用此引物进行PCR扩增，得到与预期相符的目的片段。目的片段的序列比较结果表明菌株A、菌株B与ATCC19410参考菌株同源性为96.8％和97.1％。结果表明，此试验中建立的PCR检测方法是成功的。用该方法同时扩增羊链球菌、马尔他布鲁氏菌、结核分支杆菌，除伪结核棒状杆菌扩增出1条特异的条带外，其余的均无条带产生，证明了该PCR检测方法具有很强的特异性。同时，采集17份疑似CLA病料进行检测，其中有12份病料均为阳性结果，阳性率为70.6％，扩增结果与病原菌的分离鉴定结果完全吻合。

目录

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文献综述第一章羊干酪样淋巴结炎研究进展

1.1病原学研究

1.1.1伪结核棒状杆菌的分类地位

1.1.2菌体形态及染色

1.1.3营养要求与培养特性

1.1.4生化特性

1.1.5抗原性及毒力

1.1.6抵抗力

1.2发病状况

1.2.1流行病学

1.2.2发病机理

1.2.3临床症状

1.2.4病理变化

1.3诊断方法

1.4免疫预防

1.5治疗方法

1.6综合防治

试验研究第二章病原分离与鉴定

2.1材料

2.1.1病料

2.1.2参考菌株

2.1.3试验动物

2.1.4培养基

2.2方法

2.2.1病原菌的分离培养及形态染色特性检查

2.2.2分离菌的运动性检查

2.2.3生化试验

2.2.4动物致病性试验

2.3结果

2.3.1病原菌分离培养及形态染色特性

2.3.2运动性

2.3.3生化特性

2.3.4动物致病性试验结果

2.4讨论

试验研究第三章酶联免疫吸附试验(ELISA)

3.1材料

3.1.1血清、抗原和菌株

3.1.2试剂

3.1.3仪器

3.2方法

3.2.1外毒素抗原的制备

3.2.2阴性血清的制备

3.2.3阳性血清的制备

3.2.4奶山羊血清IgG的提取

3.2.5 ELISA最佳条件的选择

3.2.6 ELISA结果的判定

3.2.7 ELISA检测方法特异性试验

3.2.8待检血清的检测

3.3伪结核的ELISA诊断试验结果

3.3.1酶标抗体最适浓度的选择试验结果

3.3.2外毒素抗原和阳性血清最适浓度的选择试验结果

3.3.3阴性血清临界值的确定

3.3.4特异性试验

3.3.5待检血清的检测结果

3.4讨论

3.4.1选择ELISA检测方法的依据

3.4.2包被抗原

3.4.3结果判断

3.4.4质量控制指标

试验研究第四章伪结核棒状杆菌PCR检测方法的建立

4.1材料

4.1.1菌株及病料

4.1.2主要试剂

4.1.3仪器与设备

4.2方法

4.2.1引物设计与合成

4.2.2核酸的提取

4.2.3 PCR扩增

4.2.4 PCR扩增产物的鉴定及序列分析

4.2.5 PCR特异性试验

4.2.6病料检测

4.3结果

4.3.1 PCR扩增产物的鉴定

4.3.2 PCR产物的核苷酸序列分析

4.3.3 PCR方法的特异性鉴定

4.3.4采集病料的部分检测结果

4.4讨论

4.4.1 PCR检测方法特异性强

4.4.2 PCR快速检测

4.4.3建立的PCR方法与其他诊断方法的比较

结论

参考文献

致谢

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