小鼠卵母细胞孤雌激活、去核方法及受精卵体外培养研究

摘要

小鼠卵母细胞相对较小，显微操作易导致胞质散裂，因此小鼠核移植难度较大，成功率较低，其中培养液、激活条件、去核方法都极大地影响其成功率。本研究通过对小鼠受精卵体外培养体系，MII期卵母细胞孤雌激活条件的筛选以及探讨MII期卵母细胞的去核方法为小鼠体细胞核移植的成功奠定基础。 1、筛选最佳的小鼠胚胎体外发育培养体系，并进一步探讨不同浓度的FBS、PVA、hLIF对其体外发育的影响，从而为小鼠卵母细胞核移植后重构胚的体外培养提供支持。试验Ⅰ：分别用自配的M16、mM16、KSOM、mKSOM、CZB进行体外发育培养，进而筛选出一种最佳的体外培养体系；在筛选出培养液的基础上进行试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，分别探讨FBS、PVA、hLIF对小鼠胚胎发育的影响。结果，试验Ⅰ中，受精卵培养效果最好的培养液为mM16，其次为mKSOM，在这两种培养液中，胚胎发育到4-细胞的比率分别为94.7％(91/96)和85.8.％(73/85)，发育到桑椹胚/囊胚的比率分别为84％(80/96)和81.1％(69/85)，均明显高于其他三种培养液(p＜0.05)；试验Ⅱ，用5％FBS、10％FBS或15％FBS代替mM16中的BSA时，胚胎发育至桑椹胚或囊胚的比率明显下降，分别为32.6％、35.8％，与对照组(82.1％)差异显著(p＜0.05)；试验Ⅲ，用0.05mg/mLPVA、0.1mg/mLPVA、0.5mg/mLPVA或1mg/mLPVA取代mM16中的BSA，胚胎不能发育到桑椹胚/囊胚，与对照组差异显著(p＜0.05)；试验Ⅳ，三种不同浓度的hLIF均能提高胚胎在体外的发育率，但以1000IU/mL浓度的hLIF效果最好。表明在不添加其他成分前提下，只在M16中添加0.1mmol/LEDTA、0.5mmol/L牛磺酸、1000IU/mLhLIF便可获得84％的囊胚率；FBS和PVA不能有效取代mM16中的BSA。 2、采用不同的激活方法对小鼠卵母细胞进行孤雌激活研究。小鼠注射hCG13h后，采集卵母细胞并在体外培养4h～5h，分别采用乙醇、氯化锶、电脉冲对卵母细胞进行孤雌激活。结果显示：乙醇对小鼠卵母细胞的孤雌激活效果最好，其次是氯化锶，电脉冲对小鼠卵母细胞的孤雌激活效果较差；8％的乙醇激活5min，其激活率可达97.9％，随后激活卵发育到桑椹胚/囊胚的比率为85.4％，与其他乙醇激活组差异显著；在氯化锶的激活组中，用2mmol/LSrCl2和5μg/mLCB处理卵母细胞1h，其激活效果最好；含有1％DMS0的氯化锶激活组中，卵母细胞的激活率普遍高于含5μg/mLCB的氯化锶激活组，差异显著(P＜0.05)，但随后激活卵发育到桑椹胚或囊胚的比率明显低于含5μg/mlLCB的氯化锶激活组，差异极显著(P＜0.01)；电脉冲对小鼠卵母细胞激活率和随后激活卵的发育率普遍都较低，其中以场强为2.0kv/cm，持续时间160μs,连续两次激活效果较好，卵母细胞的激活率及随后囊胚发育率分别为64.5％和37.5％与其他电脉冲激活组差异显著(P＜0.05)。表明8％乙醇激活的小鼠卵母细胞有较强的体外发育能力。 3、分别采用“盲吸法”、“点击法”、“负压-点压法”三种不同的方法对MII期小鼠卵母细胞进行去核，并初步探讨了卵母细胞采集时间、操作液中添加不同浓度的蔗糖以及操作时的温度对小鼠卵母细胞去核的影响。其结果显示卵母细胞在hCG注射后12.5h采集，此时有67.1％的卵母细胞核纺锤体位于第一极体的下方，与其他时间段采集效果差异显著(P＜0.05)；在操作液中添加3％的蔗糖，在普通倒置显微镜下可以较清楚的显示卵母细胞的核区；操作环境温度过高，会加速卵母细胞在操作液中的死亡，不利于操作；采用负压-点压法去核，其卵母细胞的去核率可达62.8％，与其他两种方法所获得的去核率差异显著(P＜0.05)。表明“负压-点压法”是一种简单、有效的小鼠卵母细胞去核方法。

目录

文摘

英文文摘

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第一部分文献综述第一章啮齿类体细胞核移植的研究进展

第一部分文献综述第二章体细胞核移植机理的研究进展

第二部分试验研究第三章小鼠原核期受精卵体外培养体系的筛选

第二部分试验研究第四章乙醇、氯化锶、电脉冲对小鼠卵母细胞孤雌激活后体外发育的研究

第二部分试验研究第五章小鼠卵母细胞去核方法的研究

结论

参考文献

致谢

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