昆明小鼠卵母细胞孤雌激活及去核的研究

摘要

自1998年首例体细胞克隆小鼠成功后，小鼠体细胞核移植技术逐渐成熟，许多品系的小鼠在体细胞核移植上的都取得了成功，得到了克隆后代，但昆白小鼠却一直未见成功的报道。昆白小鼠作为我国一种重要的小鼠品系，具有遗传背景清楚、生殖周期短、环境适应能力强等优点，广泛应用于药理，毒理、微生物学的研究以及药品、生物制品的检定，是国内良好的实验动物模型。 本研究从3个方面对昆白小鼠体细胞核移植进行了研究：小鼠原核期受精卵体外培养液的筛选，不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响和去核方法的研究。 1.体外培养环境显著影响小鼠植前胚胎的发育，许多品系小鼠胚胎明显表现出2-细胞阻滞，包括昆明白小鼠。因此，找到一种稳定的克服2-细胞阻滞的培养体系十分必要。本实验在小鼠输卵管上皮细胞共培养的基础上，比较了小鼠精原核形成期受精卵在CZB、M16、KSOM、mCZB、mM16、mKSOM6种培养液中体外发育的能力。从而获得一种可以有效支持昆明小鼠受精卵体外发育最佳的培养体系，为小鼠核移植重构胚的培养奠定基础。实验结果表明，共培养系统对胚胎早期发育具有明显的促进作用。改良的M16、KSOM培养液可以满足小鼠胚胎早期发育的要求，可获得较高的囊胚率，分别为80.23％、78.82％，可以作为小鼠体细胞核移植重构胚体外培养液。 2.通过7％的乙醇处理6～9min，含2、5、8、10mmol/MLSrCl2加上5μg/MLCB的M16培养液激活处理5小时，含10mmol/mLSrCl2加上5μg/M1CB的M16培养液激活处理3、4、5、6h，先用7％乙醇激活处理7min，再用10mmol/mLSrCl2+5μg/mLCB激活处理5小时等4种方法对卵母细胞激活效果的比较。实验结果表明：乙醇激活获得了较高的激活率(91.76％)和囊胚率(76.47％)；较高浓度的SrCl2或充足的处理时间均可以激活小鼠卵母细胞，并使之有发育至囊胚的能力；乙醇的激活效果好于其他激活方式。因此，使用乙醇作为小鼠卵母细胞的激活剂是可行的。 3.为了提高小鼠MⅡ期卵母细胞的去核效率及质量，本研究在如下不同条件下，比较了小鼠卵母细胞的去核效果：将小鼠MⅡ期卵母细胞放入含蔗糖浓度分别为0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL的M2-微滴中，在体式显微镜下显核效果已确定最佳浓度；将有清晰可见细胞核的卵母细胞放入含CCB浓度分别为5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL操作液中去核，显微镜下确定去核率。结果表明：去核时在如下条件下，可以取得最佳去核效率：(1)操作液中加入蔗糖浓度为0.02g/mL时显核效果最好；(2)去核时操作液中细胞松弛素B(cytochalasin-B，CB)浓度为10μg/mL时去核死亡率最低。实验证明，在含2％的蔗糖，10μg/mL的细胞松弛素的操作液中，昆白小鼠MⅡ期卵母细胞直接去核是可行的。

目录

文摘

英文文摘

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文献综述 第一章哺乳动物核移植的研究进展

实验研究 第二章小鼠原核期受精卵体外培养液的筛选

实验研究 第三章不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响

实验研究 第四章昆明小鼠卵母细胞去核效果的研究

总结

参考文献

附录

致谢

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