小鼠睾丸支持细胞和胰岛共培养的试验研究

摘要

近年来，糖尿病患病率在世界各国急剧上升，成为严重威胁人类健康和生命安全的主要疾病。如何攻克这一世界性难题，消除患者的痛苦已逐渐成为全球性问题。国内外从各个方面进行了研究，除了药物治疗以外，胰岛移植是治疗胰岛素依赖型糖尿病的有效方法之一，故而成为国内外研究、攻克的重点。如何分离、纯化足够数量和最佳质量的胰岛，有效延长胰岛的体外存活时间以及消除胰岛移植后的免疫排斥反应，是当前胰岛移植治疗糖尿病面临的一大难题。睾丸支持细胞(sertolicell,SC)是睾丸组织中支持生精过程的关键细胞，同时具有营养、支持、分泌、吞噬和免疫豁免等重要的功能。针对目前胰岛移植和睾丸支持细胞的研究现状，本试验先开展和优化了小鼠胰岛和睾丸支持细胞的分离、纯化、培养方法的研究，然后将不同数量的睾丸支持细胞和胰岛在相应的培养条件下进行共培养，从而探求睾丸支持细胞为胰岛提供新的微环境，保持胰岛的良好功能，有效延长胰岛的体外存活时间，为胰岛移植的广泛应用提供理论和技术依据。 实验采用机械分离和胶原酶两步消化法对小鼠胰岛进行分离，并采用滤网过滤、聚蔗糖(Ficoll-400)密度梯度离心、24h转皿培养对分离的胰岛进行纯化，荧光显微镜观察胰岛培养时的形态结构，荧光免疫法测定胰岛素分泌量；采用胰蛋白酶和胶原酶分步消化方法从小鼠睾丸中分离睾丸支持细胞，然后用1/3Hanks低渗液对分离的细胞进行低渗处理，培养至24h再用50mmol/L、pH为7.1的Tris-HCL液纯化处理，应用HE染色和油红O染色方法观察睾丸支持细胞的形态结构和生物学特性；用不同数量的睾丸支持细胞与胰岛共同培养，荧光显微镜观察胰岛培养时的形态结构，荧光免疫法和比色法测定胰岛素分泌量和胰淀粉酶的含量，获得如下研究结果。 1.分离纯化后平均每只小鼠能获取642±57个胰岛(IEQ单位)，约有85％的胰岛直径在100～300μm之间，为符合移植要求的胰岛，经双硫腙(DTZ)特异性染色鉴定，纯度为90％，台盼兰染色结果显示活率在90％以上。在用胶原构建的细胞外基质上培养的胰岛能够长期维持良好的形态结构，胰岛素分泌能力和糖刺激反应性均超过对照组(刺激指数分别为3.31±0.21，1.95±0.17)。 2.经胰蛋白酶和胶原酶分步消化，1/3Hanks低渗液和Tris-HCL液纯化处理，平均每个睾丸可获得4×105个睾丸支持细胞，细胞的纯度可达90％，活细胞占总数95％。 3.胰岛单独培养至8天时，胰岛数目明显减少，胰岛出现萎缩，并出现中央坏死，存活率明显下降，培养2周后，大部分胰岛细胞团缺乏正常结构，胰岛素基础分泌量及对葡萄糖刺激的反应性显著下降；胰岛与睾丸支持细胞共同培养19d后，依然保持良好的形态结构，未见细胞萎缩退化改变，并且具有旺盛的胰岛素分泌功能，对葡萄糖刺激的反应性良好。同时外分泌腺细胞活性鉴定结果显示，共同培养组随着培养时间的延长胰淀粉酶含量迅速下降，其检测值于第¨天时即达到最低限。表明睾丸支持细胞能够促进胰岛迅速增殖，抑制外分泌部细胞，使胰岛快速纯化，保持较高的纯度。同时显示，1×106个睾丸支持细胞和100个胰岛当量(IEQ)共培养时，对胰岛的促进效果优于1×105个睾丸支持细胞和100个胰岛当量(IEQ)共培养。另外，睾丸支持细胞对受损的胰岛具有修复和支持作用，从而能够促进受损胰岛功能的恢复。结果进一步表明，睾丸支持细胞能为胰岛在体外提供一个新的微环境，有效延长胰岛的存活时间，保持良好的分泌功能，为胰岛的体外保存提供了一种新的方法，为胰岛移植治疗糖尿病奠定了理论与技术基础。

目录

文摘

英文文摘

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第一章文献综述 睾丸支持细胞和胰岛共培养及移植治疗糖尿病的研究进展

试验研究 第二章胰岛的分离纯化、鉴定及体外培养研究

第三章睾丸支持细胞的分离培养

第四章睾丸支持细胞和胰岛体外共培养

结论

下一步工作设想

参考文献

缩略词索引表

致 谢

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