重组巴斯德毕赤酵母发酵生产几丁质酶的研究

摘要

几丁质广泛分布于动物、微生物体内，是自然界中含量仅次于纤维素的生物多聚物，年生物合成量达100亿吨。作为自然界中唯一大量合成的碱性多糖，其具有很多不同于其他多糖的特性，并显现出独特的应用价值，是糖生物学开发应用研究的一个热点。 几丁质酶(EC3.2.1.14)能将几丁质β-1，4糖苷键水解，最终分解为N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)。在作物抗真菌病害、人类治疗真菌病、几丁质深加工等领域前景看好。因此，几丁质酶的批量生产势在必行。本研究的内容即是采用一株Mut<'+>表型的重组巴斯德毕赤酵母生产水稻碱性几丁质酶，对发酵过程进行优化，并对其理化性质进行分析。 试验在摇瓶水平对巴斯德毕赤酵母表达几丁质酶的诱导条件进行了研究，得到的结果为：培养基以有机培养基BMMY为宜；离心与否对外源蛋白表达影响不大；添加0.5％的(NH<,4>)<,2>SO<,4>、0.05％的油酸、添加1.0％的甲醇混合0.1％的甘油、0.67％的YNB、1.5％的酵母抽提物、pH6.0、每12 h补加一次甲醇、诱导108 h，重组几丁质酶表达量最高，提高甲醇浓度稳定性有利于蛋白表达量的提高；而添加氧载体抑制外源蛋白表达；表面活性剂诱导杂蛋白分泌;降低诱导温度不利于重组几丁质酶的表达。可以此作为发酵罐培养流加成分的参考。 在7 L发酵罐进行了放大试验，发现该菌株利用甲醇能力较强，完全能够以溶氧振荡为指针指示甲醇流加，通过蠕动泵连续流加甲醇诱导，外源蛋白表达量峰值比摇瓶诱导提前了近24 h，在84 h蛋白表达量达462.41 mg/L，单位得率提高了近2.7倍；几丁质酶酶活达到77.61 U/mL。 为进一步提高几丁质酶的表达量，在诱导阶段进行了甘油-甲醇混合碳源流加策略和甘油-甲醇交替流加策略。甘油．甲醇混合流加过程中甘油的限制性流加改善了菌体生长状况，菌体密度达到一个更高的水平，酵母生理活性的提高使诱导期得以延长，带动甲醇进一步诱导蛋白表达，表达量达到了495.33 mg/L，几丁质酶酶活达到88.31 U/mL;甘油-甲醇碳源交替流加策略打破了毕赤酵母细胞内AOX1的平衡，延缓了酵母细胞内AOX1饱和的时间，外源蛋白表达速率下降的趋势得以缓解，在120 h外源蛋白最高表达量达到516.45 mg/L，几丁质酶酶活达到99.3 U/mL。 对发酵上清液进行了硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-100柱层析，得到纯化的几丁质酶。发现该几丁质酶对热不敏感：在酸性pH范围内酶活性较高，并且表现为双峰型，在碱性pH中酶活性降低，印证巴斯德毕赤酵母正确表达了水稻碱性几丁质酶。该几丁质酶对病原真菌(Rhizopus stolonifer，Botrytis cinema)扩展初期表现出抑制作用，但后期抑制效果不明显。

目录

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第一章文献综述

1.1几丁质与几丁质酶

1.1.1几丁质

1.1.2几丁质的降解方式

1.1.3几丁质酶的分类

1.1.4几丁质酶的分子生物学

1.1.5几丁质酶的催化机理

1.1.6几丁质酶的分子进化

1.1.7几丁质酶的应用

1.2巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白研究进展

1.2.1巴斯德毕赤酵母的甲醇代谢特性

1.2.2巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的一般步骤

1.2.3外源基因导入巴斯德毕赤酵母的方法及其比较

1.2.4外源蛋白的糖基化

1.2.5影响巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达的内在因素

1.2.6影响外源蛋白表达的培养条件

1.2.7巴斯德毕赤酵母的发酵罐培养策略

1.2.8巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白展望

1.3本研究的目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3流加溶液

2.1.4实验所需主要药品与仪器设备

2.2灭菌方法

2.3发酵方法

2.3.1菌种的保藏

2.3.2种子活化

2.3.3摇瓶水平菌体培养

2.3.4摇瓶水平重组几丁质酶的诱导表达

2.4分析方法

2.4.1菌体湿重测定方法

2.4.2铵离子浓度测定:酚-靛蓝法

2.4.3甲醇浓度测定

2.4.4发酵液中甘油浓度的测定

2.4.5总蛋白测定:Bradford法

2.4.6几丁质酶酶活力测定

2.4.7 SDS-PAGE电泳分析表达产物

第三章摇瓶诱导条件研究

3.1诱导培养基成分的优化

3.1.1有机与无机培养基的效果比较

3.1.2诱导阶段甲醇浓度的影响

3.1.3油酸对蛋白表达的影响

3.1.4(NH4)2SO4浓度的影响

3.1.5氧载体的影响

3.1.6表面活性剂的影响

3.2发酵条件的优化

3.2.1 BMGY离心的影响

3.2.2甲醇补料间隔时间的影响

3.2.3甲醇诱导时间的影响

3.2.4不同pH对表达外源蛋白的影响

3.2.5温度对外源蛋白表达的影响

3.2.6混合补料的影响

3.3正交设计法优化培养基配方试验

3.4正交试验的验证

3.5讨论

3.5.1重组毕赤酵母诱导培养基的选择

3.5.2添加剂的影响

3.5.3甲醇浓度稳定性的影响

3.6小结

第四章P.pastoris发酵罐培养的研究

4.1发酵罐发酵方法

4.2甘油初始浓度的选择

4.3以甘油为碳源的发酵动力学

4.4诱导阶段不同补料策略的影响

4.4.1流加单碳源甲醇诱导几丁质酶表达

4.4.2甲醇-甘油混合流加

4.4.3甘油-甲醇交替补料诱导蛋白表达

4.5不同补料策略对酵母生长的影响

4.6讨论

4.7小结

第五章几丁质酶的基本性质研究

5.1几丁质酶酶活力测定条件的优化

5.1.1反应时间对几丁质酶的影响

5.1.2蜗牛酶的影响

5.1.3 K2B4O7、DMAB的影响

5.2几丁质酶液的初步分离纯化

5.2.1硫酸铵分级沉淀

5.2.2透析液Sephadex G-100凝胶柱层析

5.2.3 SDS-PAGE电泳鉴定

5.3重组几丁质酶的酶学基本性质

5.3.1 pH对酶反应和稳定性的影响

5.3.2温度对酶反应和稳定性的影响

5.3.3不同金属离子对几丁质酶酶活的影响

5.4几丁质酶对真菌生长的抑制作用

5.5讨论

5.5.1几丁质酶酶活的大小

5.5.2几丁质酶的抑菌活性

5.6 小结

第六章结论

6.1结论

6.2创新点

参考文献

附录

致谢

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