巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶的研究

摘要

本文对含人溶菌酶基因的PichiaPastorisGS115的发酵条件进行了研究，通过考察酵母生长规律，工业培养基中碳源、氮源的组成对酵母生长的影响以及不同诱导时间、不同诱导pH值、混合碳源对蛋白得率的影响得出了优化的发酵条件：酵母在培养36h后(即甘油耗尽1-2h后)，结束生长阶段，开始加入甲醇进行诱导表达；诱导总时间维持在72-84h(即3天到3.5天)目标蛋白收率较大；诱导期间采用混合碳源，有利于维持毕赤酵母在工业培养基的正常生长和代谢，有利于提高发酵密度，也有利于提高目标蛋白的表达量；当将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35g/L和5g/L时，酵母生长期的细胞密度与传统培养基相差不大，但培养时间可减少4h，节省了生产成本；维持诱导期间的pH=4.0对目标蛋白的表达最有利。 本文还对目标蛋白的分离纯化进行了研究，通过对不同层析柱分离效果的比较，优化了分离纯化方法：采用将SPFF强阳离子与DEAE弱阴离子交换层析柱偶联的分离方法，达到进一步除杂，并浓缩目标蛋白的作用，目标蛋白产量约为50mg/L。对于SPFF强阳离子交换层析柱，采用Na2HPO4-NaH2PO4(CNa+=50mM)，pH7.0缓冲体系，同时洗脱缓冲体系维持NaCl浓度为0.4M时分离效果较好；对于DEAE弱阴离子交换层析柱，采用Tris-HCl(Ccl-=20mM)，pH8.0缓冲体系，同时洗脱缓冲体系也维持NaCl浓度为0.4M时浓缩效果较好。 本文最后对酶切方法与活性检测方法进行了简单研究，发现酵母型肠激酶可以对目标蛋白进行比较成功的酶切，酶切后的重组人溶菌酶经热激法在电镜下微观观察有较明显的杀菌作用，且经溶壁微球菌比浊法测得重组人溶菌酶的平均质量酶活性为513.3U/mg。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

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第一章文献综述

第二章重组人溶菌酶发酵条件的研究

第三章重组人溶菌酶分离纯化的研究

第四章酶切与活性检测

第五章结论与建议

参考文献

附录一 培养基

附录二 电泳液

致谢

研究成果及发表的学术论文