Nanog基因在Hela细胞中的表达及其siRNA对小鼠ES细胞生长和分化的影响

摘要

胚胎干细胞来自哺乳动物囊胚内细胞团，具有自我更新、无限增殖的能力，并具有分化成各种类型细胞的特性。胚胎干细胞多能性分子机制的研究是近年来的一个研究热点。Nanog基因作为维持ES细胞和早期胚胎细胞多能性的重要因子，研究Nanog基因在ES细胞和早期胚胎细胞中的表达机制以及与LIF/STAT3和Oct3/4之间对干细胞多能性的关系，将有助于理解ES细胞多能性维持的分子机制。同源异型蛋白Nanog能够独立于LIF/STAT3途径而维持胚胎干细胞的自我更新能力。Nanog，Oct4和Sox2是维持胚胎干细胞和内细胞团多能性的主要调控因子。Nanog基因只在胚胎干细胞或畸胎瘤细胞中表达，在成体细胞中不表达。在小鼠胚胎干细胞中，运用RNA干扰的方法抑制Nanog基因的表达会导致胚胎干细胞向胚外内胚层分化，同时促使胚外内胚层基因gata4，gata6和lamininB1的表达。对Nanog基因的研究有助于揭示胚胎干细胞全能性和自我更新能力的重要途径和调控通路，对诱导胚胎干细胞定向分化具有重要意义。 本试验克隆了小鼠Nanog基因，构建了Nanog基因的真核表达载体，在Hela细胞中成功表达了Nanog基因，并检测了Nanog基因对Hela细胞生长特性的影响。根据Nanog基因序列设计了三对针对Nanog基因的siRNA干扰片段和一对无意义siRNA片段作为阴性对照。将干扰片段转染小鼠ES细胞和P19细胞，观察干扰Nanog基因表达后其对干细胞生长和分化的影响。 本试验具体内容如下所述： 1．根据GeneBank中登录的序列设计引物，克隆小鼠Nanog基因全长915bp，对克隆片段进行测序分析，结果与GeneBank中发表的小鼠ES细胞Nanog基因序列(XM 132755，gi：20831594)同源性为99.7％。将扩增的基因片段插入到pEGFP-C1载体上，构建了Nanog基因真核表达载体pG-Nanog。向Hela细胞中转染重组载体，RT-PCR证明在Hela细胞中成功表达Nanog基因。利用G418筛选稳定转染株细胞，通过测定细胞生长曲线，PCNA染色，细胞生长周期检测等试验，证明Nanog基因能够促进Hela细胞的增殖，促使Hela细胞进入S期。 2．根据Nanog基因序列设计合成了三对siRNA干扰片段N301、N749、N845，和一对无意义siRNA片段作为对照。利用Lipofectamine 2000将这些siRNA转染ES-129细胞(来自129小鼠)，转染后培养24h，收集细胞用TriZol提取细胞总RNA，经半定量RT-PCR分析，筛选得到干扰效果最好的一对siRNAN301。用N30l siRNA转染ES-129细胞，培养至24h、48h，ES细胞集落开始松散，但仍有少数细胞维持多能性，AP染色呈弱阳性。用N301转染P19细胞，培养24h至48h，其诱导形成类胚体能力下降，所形成的类胚体活力低，贴壁能力差。

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论文说明：缩略词

声明

综述部分

第一章Nanog基因的研究进展

1.1 Nanog基因的结构及其特征

1.2 Nanog基因的功能

1.3 Nanog基因作用的机理

第二章RNA干扰研究进展

2.1 RNAi的分子机制

2.2 siRNA的制备

2.3 RNAi在基因组研究方面的应用

2.4 RNAi在医学方面的应用

2.5利用RNAi技术研究ES细胞

实验研究

第三章Nanog基因在Hela细胞中的表达

3.1材料与方法

3.2结果和分析

3.3讨论

3.4 小结

第四章siRNA干扰Nanog基因对小鼠ES细胞和P19细胞的影响

4.1材料和方法

4.2结果与分析

4.3讨论

4.4小结

结论

下一步工作设想

参考文献

致谢

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