小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1在毕赤酵母中表达的探索

摘要

小麦(Trticum aestivum)是我国乃至世界的主要粮食作物之一，其种植面积约占谷物种植面积的30％左右。小麦面粉可以加工成各种不同的食品，是人类植物蛋白质的重要来源，因此，对小麦的研究一直是人们关注的热点。小麦贮藏蛋白中的高、低分子量谷蛋白亚基是决定小麦面粉品质优劣的重要因素。低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)是小麦种子中一类重要的贮藏蛋白，占面筋蛋白的40％。研究表明，低分子量麦谷蛋白亚基与面粉的加工品质密切相关，它与高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)共同决定着面筋强度。高、低分子量麦谷蛋白亚基通过分子间二硫键形成麦谷蛋白大聚合体(GMP)；谷蛋白大聚合体的含量、组成和粒度分布影响面团的特性。麦谷蛋白亚基的类型和数量决定了大聚合体的大小和数量。因此，可以通过选择优质麦谷蛋白亚基，改变聚合体的组成，提高大聚合体的含量来改良面团的加工特性。 本研究以本课题组构建的含小偃6号低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的重组质粒pGEM-XYGluD3-LMWGS1为模板，利用PCR技术扩增出基因XYGluD3-LMWGS1的完整编码区，构建成酵母表达载体，电激法转化酵母，并对转化子进行目的基因XYGluD3-LMWGS1进行蛋白诱导表达研究，研究取得以下结果： 1．通过PCR扩增得到低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的完整编码区，构建了克隆载体pMD18-simple T-xYGluD3-LMWGS，通过酶切对克隆载体进行了鉴定和测序，证实所获得的基因编码区序列与克隆的XYGluD3-LMWGS1中的可读框序列完全一致。表明基因XYGluD3-LMWGS1基因已经克隆进PMD18-simple T中。 2．将克隆载体pMD18-simple T-XYGIuD3-LMWGS和酵母表达载体pPIC3.5K用相同的限制性内切酶切割，回收目的片段，用T4 DNA连接酶将两者连接，筛选得到重组酵母表达载体，经酶切鉴定和测序，XYGluD3-LMWGS1基因已经正确连接到pPIC3.5K上。 3．用电激法将重组酵母表达载体导入甲醇型酵母(Pichia.pasteoris)菌株GS115中，获得转化子，将转化子进行PCR筛选，得到酵母重组菌株。 4．在以甲醇为唯一碳源的培养基上培养，对重组酵母菌株进行了诱导表达。经过SDS-PAGE电泳检测，未发现目的蛋白表达，对诱导表达条件和目的基因序列进行分析发现，目的基因中酵母非偏爱密码子占总密码子的42％，大量稀有密码子的使用可能导致翻译过程中出现瓶颈效应，以及诱导时的PH值，温度及蛋白水解酶等因素可能最终导致目的蛋白的不表达。

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第一章文献综述

1.1小麦种子储藏蛋白概述

1.2麦谷蛋白与小麦品质的关系

1.2.1 麦谷蛋白与品质关系

1.2.2麦谷蛋白大聚合体与品质关系

1.3小麦麦谷蛋白亚基基因的克隆与功能研究进展

1.3.1谷蛋白亚基基因的克隆研究进展

1.3.2谷蛋白基因功能研究进展

1.4毕赤酵母基因表达系统的研究进展

1.4.1毕赤酵母的特点

1.4.2利用毕赤酵母表达系统的优点

1.4.3毕赤酵母表达载体的构成及受体菌株

1.4.4重组表达载体与毕赤酵母的转化及整合

1.4.5在毕赤酵母中表达的外源基因

1.4.6影响外源基因表达量的因素

1.5本研究的目的和意义

第二章小麦低分子量麦谷蛋白基因酵母表达载体的构建

2.1试验材料

2.1.1低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1

2.1.2菌株与质粒

2.2研究方法

2.2.1低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1编码区的扩增

2.2.2低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1酵母表达载体的构建

2.3结果与分析

2.3.1目的片段的获得

2.3.2克隆载体的构建和阳性克隆的鉴定

2.3.3真核表达载体的构建

2.3.4重组质粒序列的测定及分析

2.4 讨论

2.5结论

第三章低分子量麦谷蛋白基因XYGLUD3-LMWGS1的酵母表达

3.1材料

3.1.1菌株与载体

3.2.2培养基

3.2研究方法

3.2.1毕赤酵母的转化和筛选

3.2.2重组酵母的培养和目的基因的诱导表达

3.2.3表达蛋白的分析

3.3结果与分析

3.3.1酵母细胞的转化与重组酵母菌株的PCR鉴定

3.3.2目的基因在酵母细胞中的诱导表达

3.4讨论

3.4.1转化子的PCR鉴定

3.4.2外源基因的表达验证及其分析

3.5结论

3.6下步研究设想与计划

参考文献

致谢

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