人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

摘要

先天性免疫是机体防御病原体感染的第一道防线，而BCL10(B cell lymophoma-10)是先天性免疫系统的一个重要功能基因。体外细胞转染试验证实该蛋白具有激活NF-κB蛋白家族的信号传导分子通路和诱导细胞凋亡的活性。BCL10蛋白的正常生理水平表达可以通过激活NF-κB信号通路促进B细胞的发育成熟，从而促进免疫因子的产生，增强机体的先天免疫和抵御细菌类病原体感染的能力；相反，BCL10蛋白的过量产生会促生一系列免疫抑制因子，可能导致淋巴瘤等多种疾病的发生。为探讨BCL10基因在猪体内的功能，本研究结合生物信息学方法和分子生物学实验，依照人BCL10基因序列克隆到BCL10蛋白的猪体同源性基因，并对该基因编码蛋白质的功能进行了系统的基因组学分析，同时对其表达规律和特点进行了初探，获得了以下结果。 1.根据基因存在论(Gene Ontology)与同源比对算法，以已获得的人BCL10基因为线索，根据猪基因表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)与猪基因组数据库资料，电子克隆获得了猪的同源基因。并对获得的新基因进行了开放阅读框(ORF)的寻找、全长cDNA的识别及基因转录调控基序分析。分子生物学试验验证了该基因的存在，其ORF共702个核苷酸，编码233个氨基酸。序列5'端富含GC序列，最大ORF第一个起始密码子为ATG，紧邻ACC序列，具典型的Kozak序列，符合真核细胞RNA有效转录的需要。同时，将克隆到的新基因序列提交至GenBank进行验证，获得注册号：ELJ088132。 2.利用生物信息学方法对猪BCL10蛋白遗传进化特点及功能结构域进行了系统的基因组学分析，推测其二级结构以螺旋为主，不含有跨膜区，很可能是核内蛋白。并将其定位于猪的4号染色体(chromosome 4)上，确定存在3个外显子。其编码的氨基酸含有一个CARD结构域，从而推测其在细胞凋亡中扮演着重要角色。为对其功能的深入研究指明方向。 3.采用半定量PCR检测了猪在正常情况下7个重要组织(心脏、肾脏、脾脏、胸腺、大脑、肝脏和下颌淋巴结组织)中BCL10基因mRNA表达丰度，利用SPSS11.5软件进行单因素试验统计分析与显著性检验。研究结果表明，BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高，胸腺、大脑和下颌淋巴结表达次之，肝脏只有微量表达，肾脏没有检测到表达。初步掌握了该基因在猪体内的表达特点。 4.将BCL10基因与高效的带有绿色荧光标记的真核表达载体pEGFP-C1相连，构建了重组质粒pEGFP-BCL10。利用 Lipofectamine 2000 Regent转染pEGFP-BCL10和pEGFP-C1质粒于PK-15细胞中，由最佳G418浓度抗性筛选在12 d后分别得到转染pEGFP-BCL10与pEGFP-C1的阳性细胞。显微镜下观察到典型的带有绿色荧光标记的细胞形态，进一步用RT-PCR方法验证BCL10基因得到了成功表达。同时，构建了表达BCL10蛋白的原核表达载体pET-BCL10。将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，用IPTG进行诱导表达，结果使目的蛋白获得了高效表达。以上结果初步掌握了BCL10基因在体外表达的条件和特点，为进一步对BCL10蛋白的免疫学特性、功能的研究和检测试剂盒的开发奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述：第一章BCL10基因研究进展

1.1 BCL10蛋白的结构与功能特点

1.2 BCL10蛋白在免疫系统的作用机制

1.2.1黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的研究进展

1.2.2 NF-KB信号通路

1.2.3 BCL10基因在MALT淋巴瘤中的作用机制

文献综述：第二章生物信息学在基因功能研究中的应用

2.1生物信息学的概念

2.2生物信息学的基本内容

2.2.1 DNA序列的比对和分析

2.2.2基因识别

2.2.3蛋白质结构分析与预测

2.2.4分子进化

2.3运用生物信息学手段寻找新基因

2.4生物信息学数据库

2.4.1信息检索系统

2.4.2蛋白质基本性质分析数据库

2.4.3蛋白质二级结构预测数据库

2.4.4蛋白质三级结构预测软件

试验研究：第三章猪天然免疫新基因BCL10的克隆与生物信息学分析

3.1材料

3.1.1组织来源

3.1.2主要试剂和工具酶

3.1.3菌株及载体

3.1.4主要仪器与设备

3.1.5试剂及溶液配制

3.1.6主要分子生物学软件

3.1.7主要数据库与在线分析工具

3.2方法

3.2.1候选基因BCL10的电子克隆策略

3.2.2电子克隆BCL10基因的识别

3.2.3 BCL10基因的分子克隆

3.2.4阳性重组质粒的酶切鉴定

3.2.5 BCL10基因序列测定与结果分析

3.2.6 BCL10基因核苷酸序列及推导氨基酸序列分析

3.2.7 BCL10基因系统发生进化关系分析

3.2.8 BCL10基因序列结构与生物信息学分析

3.3结果与分析

3.3.1 BCL10基因的电子克隆结果

3.3.2获得新序列的开放阅读框的寻找、全长cDNA的识别及基因转录调控基序分析

3.3.3 BCL10基因的RT-PCR扩增

3.3.4重组质粒的酶切鉴定结果

3.3.5测序结果及分析

3.3.6不同物种间BCL10基因的同源性比对

3.3.7 BCL10基因系统发生进化关系分析

3.3.8猪BCL10蛋白的生物信息学分析

3.4讨论

3.5小结

试验研究：第四章猪BCL10基因的组织表达差异研究

4.1材料

4.1.1组织来源

4.1.2主要试剂和工具酶

4.1.3主要仪器

4.2方法

4.2.1 RNA提取

4.2.2反转录

4.2.3 PCR扩增

4.2.4 RT-PCR扩增产物的电泳和定量分析

4.2.5统计分析

4.3结果与分析

4.3.1各组织提取的RNA

4.3.2各组织BCL10及其β-actin基因的扩增

4.3.3各组织BCL10基因mRNA表达丰度的差异性检验

4.4讨论

4.5小结

试验研究：第五章猪BCL10基因在哺乳动物细胞中的表达

5.1材料

5.1.1质粒与菌株

5.1.2工具酶、主要试剂和耗材

5.1.3质粒纯化试剂

5.1.4细胞培养用试剂

5.1.5细胞消化试剂ATV(Antibiotic trypsin versen)

5.1.6主要仪器与设备

5.2方法

5.2.1 BCL10重组克隆载体质粒的构建

5.2.2 BCL10基因重组真核表达质粒的构建

5.2.3重组质粒的鉴定

5.2.4阳性重组表达质粒pEGFP-BCL10及pEGFP-C1质粒的纯化

5.2.5新霉素(G418)最佳筛选浓度的确定

5.2.6 pEGFP-BCL10及pEGFP-C1质粒转染PK-15细胞

5.2.7 G418筛选及阳性细胞的获得

5.2.8转染后阳性细胞的鉴定

5.3结果与分析

5.3.1 BCL10基因的PCR扩增结果

5.3.2 BCL10基因重组克隆载体质粒的构建结果

5.3.3 BCL10基因重组真核表达载体pEGFP-BCL10的构建结果

5.3.4重组表达质粒及pEGFP-BCL10及pEGFP-C1质粒的纯化结果

5.3.5新霉素(G418)对PK-15细胞最佳筛选浓度的确定

5.3.6转染成功的鉴定及转染条件的确定

5.3.7转染后阳性细胞的获得

5.3.8阳性细胞克隆的PCR鉴定

5.4讨论

5.4.1脂质体介导的基因转染

5.4.2真核表达载体的选择

5.4.3表达BCL10蛋白阳性细胞的获得

5.5 小结

试验研究：第六章猪BCL10基因在大肠杆菌中的表达

6.1材料

6.1.1菌株与质粒

6.1.2主要工具酶和试剂

6.1.3主要仪器和设备

6.1.4普通试剂的配制

6.1.5 SDS-PAGE常用试剂配制

6.2方法

6.2.1 BCL10基因原核表达载体质粒的构建

6.2.2重组质粒的提取及鉴定

6.2.3重组质粒在大肠杆菌中的表达

6.2.4表达产物的SDS-PAGE检测

6.3结果与分析

6.3.1 BCL10基因的PCR扩增结果

6.3.2 BCL10基因克隆载体的构建结果

6.3.3 BCL10基因原核表达载体质粒的构建结果

6.3.4重组质粒pET-BCL10原核表达产物的SDS-PAGE检测结果

6.4讨论

6.4.1大肠杆菌表达系统的选择策略

6.4.2表达条件的优化

6.4.3 BCL10外源蛋白融合表达的特点

6.5小结

结论

参考文献

附录

致谢

个人简介