侵染醴肠的双生病毒及其伴随的DNAβ的分子鉴定

摘要

双生病毒是植物病毒中唯一的一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒(singlestranded DNA，ssDNA)，双生病毒可侵染双子叶和单子叶植物，且在田间通常为复合侵染，导致作物大范围受害。该病毒一般发生在热带、亚热带地区，温带地区也有发生。在我国的云南、广西、广东、海南等省的番茄、南瓜和番木瓜等多种重要作物上都发现了双生病毒的危害，有的甚至是毁灭性的危害。 本文利用双生病毒的简并引物PA和PB，对福建省福州和龙岩两地的杂草醴肠(Eclipta prostrate)进行PCR检测，结果均检测到了双生病毒。经测序，检测到的F30和F31两分离物均为空心莲子草黄脉病毒(Alternanthera yellow vein virus，AlYVV)的分离物。对两分离物DNA-A的全序列分析表明：F30及F31基因组DNA-A核酸序列相似性为96.4％。两分离物与亚洲报道的粉虱传双生病毒的基因组相似性较高，而与非洲、地中海地区报道的双生病毒相似性较低。F30与其它双生病毒比较得：其全基因组DNA-A与空心莲子草黄脉病毒(AlYVV)同源性最高，为96.4％；IR区与AlYVV-[Hn51]最为相似，具有90.3％的同源性。其4个ORFs编码的氨基酸序列与AlYVV、AlYVV-[PT1]、AlYvV-[Zin]和AlWV-[G38]分别具有最高的同源性。应用扩增DNAβ分子的通用引物对F30和F31进行：PCR扩增，结果在F30中得到一个DNAβ分子(F30β)。全序列测定分析表明：F30β全长1350nt，其互补链编码1个13.7kDa的βCl蛋白；其全序列与番茄曲叶病毒F09分离物相伴随的DNAB(Tomato leaf curl virus-[F09]，ToLCV-F09β)同源性最高，达96.7％；βC1编码的氨基酸序列与ToLCV-F09β和ToLCVp最为相似。通过分离物F30 DNA-A和DNAD的序列分析结果可推测，福建省醴肠杂草上可能存在空心莲子草黄脉病毒(A1YVV)和番茄曲叶病毒(ToLCV)的混合侵染。 我们利用双生病毒的传毒介体烟粉虱(Bemisia tabaci)，对F30分离物进行了生物学传毒试验，接种后植物的Southern blot检测结果和PCR扩增结果均证明了F30能够通过烟粉虱侵染其它植物。本文同时构建了F30分离物DNA-A的侵染性克隆，为深入研究DNA-A和DNAβ在病毒致病过程中的作用打下基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1双生病毒简介

1.2双生病毒的分类、基因组特征及寄主范围

1.2.1玉米线条病毒属(Mastrevirus)

1.2.2甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)

1.2.3番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)

1.2.4菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)

1.3伴随双生病毒的亚病毒因子

1.4双生病毒的进化

1.5双生病毒的侵染过程

1.5.1双生病毒的复制

1.5.2双生病毒的转录

1.5.3双生病毒在寄主植物体内的移动

1.6双生病毒的传播途径

1.6.1自然传播

1.6.2人工传播

1.7双生病毒侵染性克隆构建及其应用

1.8本研究的目的及意义

第二章试验材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒

2.1.2植物材料

2.1.3菌种、质粒和试剂

2.1.4供试昆虫

2.2方法

2.2.1引物设计与合成

2.2.2植物总DNA提取(CTAB法)

2.2.3聚合酶链式反应(PCR)

2.2.4目的片段的T-A克隆

2.2.5重组质粒的鉴定

2.2.6 Southern blot分析

2.2.7序列与分析

2.2.8 A1YVV-[F30]DNA-A侵染性克隆的构建

2.2.9生物学传毒实验

第三章结果与分析

3.1醴肠杂草上双生病毒的PCR快速检测

3.2病毒基因组DNA-A结构及序列分析

3.2.1全长基因组DNA-A结构

3.2.2 DNA-A序列分析

3.3样品DNAβ和DNA-B的检测

3.3.1 DNAβ分子检测

3.3.2 DNAβ分子序列分析

3.3.3检测DNA-B组分

3.4侵染性克隆的构建

3.5指示植物检测

3.5.1接种植物表现症状

3.5.2 Southern blotting检测

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1植物总DNA提取

4.2.2实验过程中遇到的问题及对策

4.3进一步研究的一点设想

参考文献

附录

致谢

作者简介、硕士期间发表论文