产单核细胞李斯特菌PCR检测方法的建立及溶血素基因的克隆与表达

摘要

产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种强致病性的食源性病原菌，已被WHO列为4种主要的食源性疾病之一，建立对该菌的快速、敏感、特异的检测方法是目前亟待解决的问题之一。 LM的致病性与多种毒力因子有关，其中溶血素O(Listeriolysin O，LLO)是该菌的主要毒力因子，它存在于所有的致病性LM中。LLO是一种能结合胆固醇、可被巯基活化的细胞溶解素，由hlyA基因编码。 本研究根据产单核细胞李斯特菌hlyA基因设计引物，进行PCR扩增，检测该方法的特异性和灵敏度。人工污染样品经Half-fraser和Fraser增菌后进行PCR检测，结果表明，产单核细胞李斯特菌扩增出234bp的条带，对照菌未扩增出目的条带，该方法的灵敏度为104 cfu/mL。人工污染样品的检出限为8 cfu/25g。说明PCR方法检测食品中产单核细胞李斯特菌具有快速、特异、敏感等特点，具有较高的实用价值。 利用PCR技术扩增产单核细胞李斯特菌溶血素基因hlyA，将其与pMD18-T载体连接，重组质粒经酶切、PCR鉴定后命名为pMD18-T-hlyA。重新设计带BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点引物，从pMD18-T-rayA扩增不含信号肽序列的目的片断，与pET32a．载体连接。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后，重组菌pET32a-hlyA用IPTG诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE，纯化后进行Western blot和间接ELISA分析。结果表明，所扩增的htyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列的同源性为99％，重组菌在大肠埃希菌BL21中表达了80ku左右的融合蛋白，经可溶性分析该蛋白以包涵体形式存在，能被LM阳性血清所识别，这为进一步研制单抗、建立间接ELISA诊断方法提供了条件。

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论文说明:缩略语

声明

文献综述第一章产单核细胞李斯特菌研究进展

1.1产单核细胞李斯特菌的危害

1.2 LM的生物学特征

1.2.1 LM的形态及培养特性

1.2.2 LM的生化特性

1.2.3 LM的理化特性

1.3 LM传播途径

1.4 临床症状

1.4.1人群临床症状

1.4.2动物临床症状

1.5 LM的致病机理及其毒力基因

1.5.1 LM的致病机理

1.5.2 LM的毒力基因

1.6 LM分型

1.6.1 LM的传统表型亚分型法

1.6.2 LM的分子亚分型

1.7 LM作为活疫苗载体的研究进展

文献综述第二章产单核细胞李斯特菌检测技术研究进展

2.1 LM的检测方法

2.1.1传统分离鉴定法

2.1.2免疫学检测

2.1.3分子生物学检测

2.2展望

试验研究第三章产单核细胞李斯特菌PCR检测方法的建立

3.1材料

3.1.1菌种

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1引物的设计与合成

3.2.2特异性试验

3.2.3灵敏度试验

3.2.4人工污染样的检测

3.3结果

3.3.1 PCR扩增条件优化

3.3.2特异性试验结果

3.3.3灵敏度试验结果

3.3.4人工污染样的检测结果

3.4讨论

3.5 小结

试验研究第四章产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆与表达

4.1材料

4.1.1菌种和载体

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.1.4主要溶液配方

4.2方法

4.2.1细菌DNA的制备

4.2.2 hlyA基因的扩增

4.2.3 hlyA基因的克隆

4.2.4原核表达载体的构建

4.2.5重组菌的诱导表达

4.2.6目的蛋白的纯化

4.2.7重组蛋白的检测

4.3结果

4.3.1引物A PCR扩增结果

4.3.2重组质粒鉴定

4.3.3引物B PCR扩增结果

4.3.4 hlyA表达载体的构建

4.3.5表达产物的SDS-PAGE电泳检测

4.3.6重组蛋白可溶性分析及纯化结果

4.3.7重组蛋白的检测

4.4讨论

4.5小结

结论

参考文献

致谢

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