小麦非生物胁迫相关LEA蛋白WZY1-2与WRAB18的功能研究

摘要

在植物的整个生命过程中，常会遭遇干旱、高盐、高温、冷害以及病虫害等逆境胁迫，影响其正常生长。逆境可造成植物细胞不同程度的损伤，严重时将直接导致植株的死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统遭到破坏、酶活性受影响以及胞内物质代谢紊乱等。植物在长期进化过程中也形成了各种防御机制来抵制这些不利因素对其自身的影响。胚胎发育晚期丰富表达蛋白（LEA蛋白），作为一类逆境相关蛋白，在植物逆境生理调控过程中发挥着重要作用。为探索该家族蛋白在植物逆境胁迫中发挥的功能，本论文以LEA蛋白第二家族成员WZY1-2蛋白和第三家族成员WRAB18蛋白为研究对象，对二者在植物逆境胁迫下的功能进行了探讨。
　　WZY1-2蛋白，为LEAⅡ家族蛋白（又称脱水素、脱水蛋白）成员之一，具有该家族典型的保守序列:K片段和S片段，属于SK3型脱水素，可受多种逆境信号分子诱导表达。本研究对脱水蛋白WZY1-2及其K、S片段分别缺失的衍生蛋白在植物细胞内的定位和存在形式进行了探讨，确定了WZY1-2蛋白在细胞中的定位及存在形式，并揭示了K片段或S片段的缺失对WZY1-2蛋白的亚细胞定位以及存在形式的影响;通过在大肠杆菌和本氏烟草细胞中对WZY1-2蛋白进行过表达，研究其在干旱、高盐、高温和低温胁迫条件下对原核和真核生物抗逆性的影响。此外，本研究还通过蛋白与核酸互作的免疫共沉淀技术对脱水蛋白WZY1-2在细胞内的作用机理进行了初步探究。研究结果如下:
　　1.本研究从郑引1＃小麦中克隆获得wzy1-2基因ORF序列并在大肠杆菌中进行表达，SDS-PAGE中蛋白大小为理论分子量大小的二倍，通过双分子荧光互补(BiFC)试验进一步证实WZY1-2蛋白以同源二聚体的形式存在于植物细胞。以wzy1-2基因ORF序列为模板，利用重叠延伸PCR技术对wzy1-2基因K、S片段分别进行缺失，获得wzy1-2基因衍生物wzy1-2△K和wzy1-2△S，对二者分别进行二聚化验证，结果显示，分别缺失了K、S片段的衍生蛋白WZY1-2△K和WZY1-2△S在烟草叶片细胞内依然以二聚体的形式存在，该现象表明K、S片段并不影响脱水蛋白WZY1-2的同源二聚化。
　　2.分别构建WZY1-2、WZY1-2△K以及WZY1-2△S蛋白与GFP融合的表达载体，通过在烟草叶片瞬时表达进行蛋白亚细胞定位分析，结果显示，WZY1-2与WZY1-2△K蛋白定位于细胞核中。部分WZY1-2△S蛋白在细胞核中定位，但也有部分WZY1-2△S蛋白定位于细胞内膜和胞质中，由此可见，K片段对WZY1-2蛋白的核定位并无影响，而S片段能够影响WZY1-2的蛋白定位，但并不是决定因素。
　　3.将WZY1-2蛋白过表达的大肠杆菌BL21(DE3)菌株与作为对照的转pET28a空载菌株同时进行干旱、高盐、高温和低温胁迫，通过对比菌株生长状况，证明WZY1-2蛋白能够在逆境条件下提高大肠杆菌的生存能力;构建wzy1-2转基因载体，利用农杆菌叶盘浸染，通过组织培养获得wzy1-2转基因烟草，以野生型烟草为对照，通过对烟草生长表型、根长、发芽率、种子活力以及氧化胁迫相应生理指标进行分析，表明脱水蛋白WZY1-2可在多种非生物胁迫下增强烟草的抗逆性。
　　4.利用Ni2+柱对原核表达获得的WZY1-2蛋白进行纯化，并制备特异性抗体进行免疫共沉淀实验，将WZY1-2蛋白与低温胁迫36 h后小麦叶片基因组DNA共同孵育，对琼脂糖珠所捕获复合物分别进行核酸和蛋白电泳检测，结果显示，脱水蛋白WZY1-2能够与核酸结合。
　　WRAB18蛋白，属于LEAⅢ蛋白家族，具有LEAⅢ家族保守氨基酸序列(TAQAAKEKAGE)。本研究确定了WRAB18蛋白在植物细胞内的定位及其在干旱、高盐、高温和低温条件下，对乳酸脱氢酶(LDH)活性的保护作用。将WRAB18蛋白在大肠杆菌和烟草中进行过表达，探索其在干旱、高盐、高温和低温四种非生物胁迫条件下对原核和真核生物的作用。同时，本研究克隆获得了WRA B18基因全长及其上游启动子序列，并对启动子序列所包含的顺式作用元件进行分析。研究结果如下:
　　1.构建WRAB18蛋白C端GFP融合表达载体WRAB18-pA7GFP，通过农杆菌菌液注射使GFP∷WRAB18融合蛋白在烟草叶片瞬时表达。在GFP激光通道和mCherry通道下，利用激光共聚焦显微镜对烟草叶片细胞原生质体中GFP∷WRAB18融合蛋白和质体定位蛋白Marker(pt-rk CD3-999)进行共定位观察，结果显示，WRAB18蛋白定位于烟草叶片细胞质体中。
　　2.将纯化的WRAB18蛋白与乳酸脱氢酶(LDH)溶液分别在干燥、高盐、高温和低温条件下共同孵育，酶活性分析表明，逆境条件下，含WRAB18蛋白的反应体系中LDH的酶活性明显高于不含WRAB18蛋白的对照组。
　　3.将WRAB18蛋白分别在大肠杆菌BL21(DE3)和烟草中进行过表达，对大肠杆菌菌株以及转基因烟草分别进行干旱、高盐、高温和低温胁迫，与对照组进行比较，结果显示WRAB18蛋白的过表达可在多种逆境胁迫下提高原核和真核细胞的抗逆性。
　　4.以小麦叶片基因组DNA为模板，克隆获得WRAB18基因的全长序列610bp，其中包含1个100 bp的内含子区域和2个分别为60bp、450 bp的外显子区域。克隆获得WRAB18基因上游2000 bp序列，经Plant CARE Database分析显示，该序列包含TATA-box和CAAT-box等启动子保守元件，并含有逆境胁迫相关顺式作用元件: ABREs、GARE、LTREs、MBS等。利用实时荧光定量PCR技术对干旱、高盐、高温和低温四种非生物胁迫后小麦幼苗叶片中WRAB18基因表达量进行分析，结果表明WRAB18基因可受上述4种胁迫诱导表达。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 LEA蛋白概述

1．2 LEAⅡ 蛋白简介

1．2．1 LEAⅡ 蛋白特征及分类

1．2．2 LEAⅡ 蛋白的表达及定位

1．2．3 LEAⅡ 蛋白的功能及作用机理

1．2．4 LEAⅡ 蛋白的研究进展

1．3 LEAⅢ 蛋白简介

1．3．1 LEAⅢ 蛋白特征

1．3．2 LEAⅢ 蛋白的表达及定位

1．3．3 LEAⅢ 蛋白的功能及作用机理

1．3．4 LEAⅢ 蛋白的研究进展

1．4 植物启动子概述

1．4．1 植物启动子结构和功能

1．4．2 植物启动子研究进展

1．5 本研究的目的和意义

第二章 小麦脱水蛋白WZY1-2及其衍生蛋白的表达和序列分析

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体与菌种

2．1．3 主要试剂与仪器

2．2 方法

2．2．3 小麦wzy1-2及其衍生基因的克隆

2．2．4 小麦脱水蛋白WZY1-2及其衍生蛋白的表达

2．2．5 小麦WZY1-2及其衍生蛋白序列分析

2．3 结果与分析

2．3．2 小麦WZY1-2及其衍生蛋白的表达

2．3．3 小麦WZY1-2及其衍生蛋白序列分析

2．3．4 小麦脱水蛋白WZY1-2的纯化及抗体制备

2．4 讨论

第三章 WZY1-2及其衍生蛋白的亚细胞定位及细胞内二聚化分析

3．1 材料

3．1．2 载体与菌种

3．1．3 主要试剂与仪器

3．2 方法

3．2．1 植物材料培养

3．2．3 WZY1-2及其衍生蛋白亚细胞定位

3．2．4 WZY1-2及其衍生蛋白BiFC载体构建

3．3 结果与分析

3．3．1 小麦WZY1-2及其衍生蛋白亚细胞定位结果

3．3．2 小麦WZY1-2及其衍生蛋白二聚化验证

3．4 讨论

第四章 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫中的功能分析及作用机理研究

4．1 材料

4．1．3 主要试剂与仪器

4．2 方法

4．2．1 植物材料培养

4．2．3 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫下对大肠杆菌的作用

4．2．4 wzy1-2转基因烟草的获得

4．2．5 wzy1-2转基因烟草非生物胁迫处理

4．2．6 脱水蛋白WZY1-2与核酸互作试验

4．3．1 小麦wzy1-2基因表达规律分析

4．3．2 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫下对大肠杆菌的保护作用

4．3．3 小麦wzy1-2转基因烟草的鉴定

4．3．4 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫下增强转基因烟草抗逆性

4．3．5 小麦脱水蛋白WZY1-2与核酸互作分析

4．4 讨论

第五章 小麦LEAⅢ家族蛋白WRAB18序列分析及亚细胞定位

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 植物材料培养

5．2．2 小麦叶片总RNA的提取和cDNA第一链的合成

5．2．4 小麦WRAB18蛋白序列分析

5．2．6 WRAB18蛋白亚细胞定位

5．3 结果与分析

5．3．2 小麦WRAB18蛋白序列分析

5．3．3 小麦不同组织中WRAB18基因表达量分析

5．4 讨论

第六章 小麦WRAB18蛋白在非生物胁迫中的功能分析

6．2．2 小麦WRAB18蛋白在胁迫条件下对乳酸脱氢酶的作用

6．2．5 WRAB18转基因烟草非生物胁迫处理

6．3 结果与分析

6．3．2 小麦WRAB18蛋白在非生物胁迫下对大肠杆菌的保护功能

6．3．3 WRAB18转基因载体的构建及转基因植株的鉴定

6．3．4 WRAB18转基因烟草对非生物胁迫的抗逆性分析

6．4 讨论

第七章 小麦WRAB18全长基因和启动子序列的克隆及不同非生物胁迫下的表达分析

7．1 材料

7．1．1 植物材料

7．1．2 载体与菌种

7．1．3 主要试剂与仪器

7．2．2 小麦叶片基因组DNA的提取

7．2．5 不同胁迫下小麦WRAB18基因的表达分析

7．3 结果与分析

7．3．2 小麦WRAB18基因全长序列及启动子功能元件的分析

7．3．3 小麦WRAB18基因在不同非生物胁迫下的表达量差异

7．4 讨论

第八章 总结与展望

8．1 全文总结

8．1．2 WRAB18蛋白研究结论

8．2 展望

参考文献

附录

缩略词表

致谢

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