小麦与叶锈菌互作中Wrab18基因的克隆、表达及功能研究

摘要

小麦（Triticum aestivum L.）属单子叶植物，是一种在世界各地广泛种植的禾本科作物，小麦的颖果是人类的主食之一。小麦叶锈菌（Puccinia triticina）是引起小麦叶锈病的一种小麦专化性寄生菌，在小麦叶锈病的流行年份能够导致小麦的大规模减产。为了进一步的探究小麦抵抗叶锈菌的机制，对于抗病相关基因的发掘就显得极为重要。我们课题组长期从事于小麦与叶锈菌互作机制的研究，在之前的研究中，我们通过构建叶锈菌侵染早期小麦的SSH文库及ESTs序列分析，发掘并初步证明Wrab17基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的诱发的过敏性反应(HR)。进一步通过构建转录组数据库，我们发现与Wrab17基因同家族的Wrab18基因在小麦抵抗叶锈菌侵染的过程中有明显上调，表明Wrab18基因参与了小麦与叶锈菌的互作过程。本试验以小麦品种洛夫林10（简称L10）与叶锈菌小种165组合为亲和组、260组合为不亲和组，进行试验，进一步探究Wrab18基因在小麦与叶锈菌互作过程中的作用。主要获得以下结果:
　　1.通过RT-PCR技术，在小麦品种L10中克隆获得Wrab18基因的全长的CDS。利用生物信息学分析，对Wrab18基因的编码氨基酸序列及二级结构进行分析预测，为后续试验奠定基础。
　　2.通过RT-qPCR技术，在叶锈菌侵染小麦后不同时间点检测Wrab18基因mRNA的表达量变化，发现在不亲和组合中Wrab18基因的早期表达量明显高于亲和组合。该结果表明，Wrab18基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染过程。
　　3.构建了Wrab18基因亚细胞定位载体，通过农杆菌介导法注射烟草叶片使Wrab18基因在烟草细胞中瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察结果表明Wrab18在细胞核及胞质中表达。
　　4.利用VIGS技术沉默L10的Wrab18基因，相比对照组，接种不亲和叶锈菌小种260后由叶锈菌引发的HR面积增大，表明Wrab18基因参与小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的HR过程。接种亲和组合叶锈菌小种165后，叶锈菌菌丝团面积无明显变化。
　　5.构建了Wrab18基因的RNAi载体，利用小麦成熟胚转化体系进行遗传转化，为后期获得稳定遗传的RNAi阳性植株奠定基础。
　　综上所述，Wrab18基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的过程，并发挥重要作用。丰富了小麦Wrab18基因在胁迫响应中作用的研究。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1．1．1 叶锈病对小麦的危害

1．1．2 叶锈菌侵入小麦的过程及细胞的过敏性反应

1．1．3 农业生产中对小麦叶锈病的控制

1．2 LEA蛋白概述

1．3 LEA3蛋白的功能与作用机制

1．4 Lea3基因的表达特点

1．5 Wrab基因家族参与抗逆研究

2．1 供试材料

2．2 试验仪器

2．3 常用培养基的配制

2．4 PCR扩增L10 Wrab18基因并获得CDS

2．4．1 总RNA提取

2．4．2 反转录

2．4．3 扩增引物设计

2．5 利用RT-qPCR检测小麦接种叶锈菌后不同时间点Wrab18基因表达量变化

2．5．1 小麦幼苗接种叶锈菌及试验取材

2．5．2 总RNA提取

2．5．3 反转录合成cDNA

2．5．4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

2．5．5 -ΔΔCt值法计算RT-qPCR结果

2．6．1 构建Wrab18-GFP亚细胞定位载体

2．6．2 农杆菌注射烟草瞬时表达

2．7．1 获得基因沉默片段和阳性克隆的筛选

2．7．2 阳性克隆质粒的提取

2．7．3 阳性质粒的酶切及基因沉默片段的回收

2．7．4 沉默片段连接pSL038-1载体与转化

2．7．5 质粒线性化

2．7．6 酶切产物纯化

2．7．7 病毒的体外转录

2．7．8 转染缓冲液(FES)配制与病毒转染

2．8 Wrab18基因沉默效率检测及功能分析

2．8．2 转染病毒叶片接种叶锈菌后的HR染色

2．8．3 HR面积和菌丝团统计

2．9．2 Wrab18基因正、反向片段与载体的连接

2．9．3 RNAi载体转化农杆菌

2．10 农杆菌介导的Wrab18 RNAi载体的遗传转化

2．10．1 小麦外植体的获得

2．10．2 农杆菌侵染转化

2．10．3 转基因植株的培育

3 结果与分析

3．2 小麦与叶锈菌互作中Wrab18基因的实时定量检测

3．3 Wrab18基因的亚细胞定位分析

3．4 VIGS技术沉默’Wrab18基因对小麦与叶锈菌互作的影响

3．4．1 Wrab18基因VIGS载体的构建及体外转录

3．4．2 基因沉默后的检测

3．4．3 Wrab18沉默效率的检验

3．4．4 沉默Wrab18基因后对HR及菌丝团面积的影响

3．5 构建Wrab18基因RNAi载体

3．5．2 Wrab18基因RNAi载体的构建

3．6 农杆菌介导的Wrab18基因小麦成熟胚遗传转化

4 讨论

4．1 遗传转化方法在实际应用中的问题研究

4．2 ABA在植物抵抗胁迫反应中的作用

4．3 Wrab18基因在抵抗逆境胁迫中的作用研究

4．4 有关Wrab基因家族研究的展望

5 结论

参考文献

在读期间发表学术论文

作者简历

致谢