光棘球海胆SRB与Lectin基因的克隆、原核表达与功能研究

摘要

光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus），俗名大连紫海胆，在分类地位上属于棘皮动物门-海胆纲-球海胆科，是中国北方海域的重要经济海胆种类，也是中国本土优良品种，其丰富的营养价值和药用价值使之广受消费者的喜爱。但是，截至目前为止，中国的光棘球海胆养殖业仍然受到病害、种质、营养等诸多问题的困扰。对于缺乏后天免疫系统的海胆等棘皮动物而言，其先天免疫系统是抵御外来病原侵袭的关键;生长相关基因的克隆和表达水平的研究也有助于促进海胆的健康养殖。研究海胆先天免疫和生长发育相关基因，能够为其良种选育提供必要的理论依据。B型清道夫受体和凝集素是两种典型的在免疫过程和发育过程中均发挥功能的基因。在本研究中，采用基因克隆、原核表达、实时定量、抑菌实验的方法对光棘球海胆B型清道夫和凝集素进行研究，主要结果如下：
　　1)克隆了3个光棘球海胆B型清道夫受体和2对凝集素基因的编码区。对于3对光棘球海胆的B型清道夫受体，分别将它们命名为SRB-1、SRB-2、SRB-3。其中，SRB-1的编码区长度1632bp，一共编码543个氨基酸，分子量大约为61.9kDa，3'UTR区长度是315bp;SRB-2编码区长度为1653bp，编码了550个氨基酸，分子量大约为62.9kDa，3'UTR区长度为220bp;SRB-3编码区长度为1512bp，编码503个氨基酸。信号肽预测的结果表明，光棘球海胆这3对B型清道夫受体均无信号肽。SRB-1和SRB-2两对清道夫受体的3'UTR区与已知的加州紫海胆与光棘球海胆的mircoRNA（简称miRNA）之间的作用关系进行了分析，结果表明这两对光棘球海胆的B型清道夫受体是不受的海胆miRNA调控的。
　　2)所克隆的2对光棘球海胆的凝集素基因分别为半乳糖凝集素8和内质网膜凝集素。前者的编码区长度为939bp，一共编码312个氨基酸，分子量大约为34.98kDa，等电点约为9.40，将该基因简写为Gal-8;后者的编码区长度为1371bp，一共编码456个氨基酸，将该基因简写为E-lectin。
　　3)光棘球海胆SRB-1、SRB-2基因的胞外区和Gal-8进行了原核表达并对这3个重组蛋白的免疫功能进行了初步探索。体外实验发现这3个蛋白能够抑制大肠杆菌、鳗弧菌的生长，但不能抑制溶藻弧菌的生长。通过实时定量PCR的方法，比较了这3个基因在不同发育阶段的海胆个体中的表达水平。
　　本研究克隆了光棘球海胆免疫和生长发育相关的5个基因，表达了2个B型清道夫受体的胞外区蛋白和半乳糖凝集素8（Gal-8）的蛋白，对其功能进行了初步探索，通过实时定量PCR比较了不同发育时期的光棘球海胆中这3个基因的表达水平。这些工作丰富了光棘球海胆先天免疫、发育的相关研究，并为其育种工作提供了一定的理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 海胆概述

1．2 海胆的营养价值及其研究进展

1．3 海胆疾病的研究进展

1．4 海胆先天免疫

1．5 凝集素

1．5．1 凝集素概述

1．5．2 半乳糖凝集素研究进展

1．6 清道夫受体

1．6．1 清道夫受体的概述

1．6．2 B型清道夫受体

1．7 MicroRNA

1．7．1 MicroRNA概述

1．7．2 miRNA的跨物种调控

1．7．3 miRNA对固有免疫的调节作用

1．7．4 水产动物miRNA与免疫关系的研究进展

1．7．5 海胆miRNA的研究进展

1．8 研究的目的和意义

第二章 光棘球海胆B型清道夫受体的克隆、分析与原核表达

2．1 实验材料

2．1．1 海胆的采集

2．2 实验方法

2．2．1 海胆RNA的提取

2．2．2 海胆RNA质量的检测

2．2．3 海胆RNA反转录

2．2．4 海胆B型清道夫受体的克隆

2．2．5 海胆B型清道夫受体的生物信息学分析

2．2．6 海胆B型清道夫受体的原核表达

2．3 结果与分析

2．3．1 海胆B型清道夫的克隆

2．3．2 海胆B型清道夫受体的生物信息学分析

2．3．3 海胆B型清道夫蛋白序列比对与进化分析

2．3．4 海胆B型清道夫受体胞外区的表达

2．3．5 海胆B型清道夫受体与miRNA的关系分析

2．4 讨论

2．4．1 光棘球海胆SRB基因的关系

2．4．2 海胆SRB的原核表达

2．4．3 B型清道夫受体的进化分析

2．4．4 清道夫受体与miRNA的关系

2．5 小结

第三章 光棘球海胆凝集素的克隆、原核表达与分析

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．2．1 海胆凝集素基因的克隆

3．2．2 海胆Gal-8生物信息学分析

3．2．3 海胆Galectin-8蛋白的比对和进化分析

3．2．3 海胆Galectin-8蛋白纯化

3．3 讨论

3．3．1 海胆凝集素的克隆与连接

3．3．2 海胆Gal-8的纯化

第四章 海胆SRB与Gal-8抑菌与表达水平研究

4．1 材料与方法

4．1．1 抑菌实验所用得重组蛋白

4．1．2 实验所用细菌

4．1．4 海胆SRB和Gal-8实时定量验证

4．2 结果与分析

4．2．1 重组蛋白的抑菌能力

4．2．2 SRB-1、SRB-2和Gal-8的表达水平

4．3 讨论

4．4 小结

5．1 主要结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

致谢

作者简介