基于组学技术解析葡萄内生菌的白藜芦醇生物合成途径

摘要

白藜芦醇是一种具有多种功能活性天然化合物，是FDA批准的膳食营养剂，在医药、食品等行业需求量大，发展微生物发酵法合成白藜芦醇势在必行。现有白藜芦醇合成途径仅见于植物，揭示微生物中白藜芦醇合成途径具有重要的科学意义。本研究在分离得到自主代谢合成白藜芦醇的链格孢霉MG1的基础上，基于GC-MS平台和HiSeq2500平台分别完成该菌的代谢谱测定及转录组测序，综合分析代谢组和转录组检测结果，从物质流向和基因水平上揭示了该菌合成白藜芦醇的代谢途径，为揭示微生物中白藜芦醇合成途径提供理论基础和事实依据，为该菌合成白藜芦醇的代谢调控奠定基础。论文的研究内容与结果如下:
　　(1)链格孢属MG1合成白藜芦醇的酶学基础
　　链格孢属MG1含有能够从葡萄糖合成白藜芦醇的完整酶系。以从链格孢霉MG1中提取的粗酶液为材料，检测了该酶液催化葡萄糖合成白藜芦醇的能力;并通过单因素试验，确定了转化体系的最适宜反应时间为120 min，添加适当浓度的丙二酰辅酶A、对香豆酸、辅酶A和ATP能够有效增加白藜芦醇产量，证明这些物质是该菌合成白藜芦醇途径中的必要物质。通过响应面分析，确定了转化体系的最优条件，使白藜芦醇产量提高近7倍。将该酶系进行海藻酸钠固定化处理后，可重复使用5次。
　　(2)链格孢属MG1合成白藜芦醇的代谢流分析
　　链格孢属MG1代谢谱的PCA和PLS-DA分析表明:生长细胞、静息细胞和静息培养液中的代谢产物存在明显差异;参考KEGG数据库，这些物质中含有白藜芦醇、白皮杉醇、苯丙酮酸、莽草酸酯、苯丙氨酸、酪氨酸、对香豆酸等26个白藜芦醇合成途径相关产物。通过代谢物质与实验所得物质流向，确定出该菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇的代谢流为:葡萄糖经糖酵解途径由6-磷酸果糖转化为丙酮酸，再经苯丙氨酸、酪氨酸生物合成途径转化为苯丙氨酸和酪氨酸，最后通过苯丙烷途径合成白藜芦醇。
　　(3)链格孢属MG1合成白藜芦醇的转录组分析
　　使用Hiseq2500测序平台对链格孢属MG1合成白藜芦醇时的转录组进行测定，下机数据经过质量控制，得到4.64 Gb Clean Data。使用转录本组装软件（Trinity）对转录组序列进行组装，共得到37163条Transcript和18570条Unigene，Transcript与Unigene的N50分别为5004和2153，组装完整性较高。
　　通过与Nr、Nt、Swiss-Prot、COG、GO以及KEGG等数据库比对，对转录组中相关基因进行功能注释，成功注释到14186条Unigene;通过代谢途径注释，将2701条Unigene定位到115个具体的代谢途径，其中有84条Unigene涉及或参与白藜芦醇合成的代谢途径，包括糖酵解途径、苯丙氨酸生物合成途径、苯丙烷途径及芪类化合物生物合成途径。其中20条Unigene可以编码芪类化合物生物合成途径的4个关键酶，包括苯丙氨酸解氨酶、对香豆酰辅酶A连接酶、肉桂酸-4-单氧酶和查尔酮合酶。
　　(4)链格孢属MG1合成白藜芦醇时的关键基因表达量分析
　　综合软件评估结果，确定用于链格孢属MG1基因表达分析的候选内参基因的稳定性排序为TUBA＞ EF1＞ EF2＞ACTB＞RPS5＞ RPS24＞ UBC＞ UFD＞18S;根据geNorm软件评估结果，确定可用于后续分析的最优内参基因组合为TUBA和EF1。不同条件下的基因表达结果表明:链格孢属MG1的糖酵解途径关键酶的表达量随菌体生长时间的变化而有所不同，但静息细胞中各关键酶的表达水平则均有不同程度增加;生长细胞的对数生长期末期(4d)，苯丙氨酸生物合成途径关键酶的表达水平普遍较高。生长细胞经静息培养后，各关键酶的表达水平普遍增加，其中以4CL的增加幅度最大，约为360倍;PAL和CHS的表达量增加了7.6倍和10.2倍;但CYP73A表达量偏低。这些结果与链格孢属MG1在静息细胞体系中能够快速合成白藜芦醇的结果相符，同时说明，这些酶是链格孢属MG1合成白藜芦醇的关键酶，而且CYP73A是合成途径中的限速酶。
　　总体而言，本研究从酶类活性、物质流向和基因表达等不同水平上确定了链格孢属MG1中白藜芦醇合成途径，证明了该途径同样存在于微生物中，并确定了其中的关键酶类及其编码基因。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物内生菌

1．1．1 植物内生菌的研究概况

1．1．2 链格孢菌

1．2 白藜芦醇

1．2．1 自藜芦醇简介

1．2．2 白藜芦醇的生产

1．2．3 产白藜芦醇的植物内生菌

1．3 白藜芦醇的生物合成途径

1．3．1 植物中自藜芦醇合成途径概述

1．3．2 植物中自藜芦醇合成途径的关键酶

1．4 代谢组学

1．4．1 概述

1．4．2 代谢组学技术

1．4．3 数据处理方法

1．4．4 微生物代谢组学研究进展

1．5 转录组学

1．5．1 转录组学的概述

1．5．2 转录组学测序技术

1．5．3 转录组学技术在微生物代谢研究中的应用

1．6 本文的研究目的与意义

1．7 研究内容和技术路线

1．7．1 研究内容

1．7．2 技术路线

第二章 白藜芦醇合成途径相关酶体系的完整性分析

2．1 材料与仪器设备

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器与设备

2．2 实验内容和方法

2．2．1 粗酶提取液的制备

2．2．2 酶活性测定

2．2．3 白藜芦醇的生物转化条件优化

2．2．5 指标测定

2．2．6 固定化酶的制备

2．2．7 固定化酶回收率及稳定性分析

2．2．8 数据分析与主要软件

2．3 结果与分析

2．3．1 链格孢属MG1中催化白藜芦醇合成的相关酶活

2．3．2 反应产物自藜芦醇的验证

2．3．3 影响链格孢属MG1的粗酶体系催化白藜芦醇合成的因素与条件

2．3．4 固定化酶用于自藜芦醇生物合成

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 白藜芦醇合成途径的相关物质解析

3．1 材料与仪器设备

3．1．1 菌种

3．1．2 培养基

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器与设备

3．2 实验内容与方法

3．2．2 代谢物的提取

3．2．4 上机检测

3．2．7 基于代谢组数据对白藜芦醇合成途径的解析

3．2．8 分析软件

3．3 结果与分析

3．3．1 链格孢属MG1代谢谱的建立

3．3．2 代谢图谱的主成分分析

3．3．3 PLS-DA判别模型

3．3．4 链格孢属MG1代谢物的注释与聚类分析

3．3．5 白藜芦醇合成相关的代谢途径解析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 链格孢属MG1无参转录组测序与质量评估

4．1 材料与仪器设备

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器与设备

4．1．5 主要软件

4．2 实验内容与方法

4．2．2 RNA的提取与检测

4．2．3 测序前处理

4．2．4 测序

4．2．5 原始数据整理、过滤及质量评估

4．2．6 序列组装

4．2．7 文库的质量评估

4．3 结果与分析

4．3．1 总RNA的质量分析

4．3．2 测序数据质量控制

4．3．3 组装结果统计

4．3．4 文库质量评估

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 基于无参转录组分析结果解析白藜芦醇合成途径的关键基因

5．1 材料与数据

5．1．1 菌种

5．1．2 转录组测序数据

5．1．3 分析软件与主要数据库

5．2 分析方法

5．2．1 Unigene聚类与注释

5．2．2 序列相似性分析

5．2．4 COG分析

5．2．5 KO分析

5．2．6 基因结构分析

5．2．7 Unigene表达量分析

5．2．8 分子进化分析

5．3 结果与分析

5．3．1 Unigene功能注释结果

5．3．2 基因序列相似性分析

5．3．3 GO分析

5．3．4 COG分析

5．3．5 KEGG分析

5．3．6 基因表达分析

5．3．7 白藜芦醇合成途径中关键酶的注释与分析

5．3．8 简单重复序列

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 内参基因筛选及途径中关键基因表达丰度分析

6．1 材料与仪器设备

6．1．1 菌种

6．1．2 培养基

6．1．3 样品采集

6．1．4 主要试剂

6．1．5 主要仪器与设备

6．2 实验内容与方法

6．2．1 RNA的提取与反转录

6．2．2 引物设计

6．2．3 实时荧光定量PCR检测

6．2．4 关键基因的表达分析

6．2．5 数据统计

6．3 结果与分析

6．3．1 RNA纯度和浓度

6．3．2 内参基因引物的特异性检验

6．3．3 内参基因表达量分析

6．3．4 内参基因的表达稳定性评估

6．3．5 最优内参基因的选择

6．3．6 关键基因表达量分析

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 结论、创新点和展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 问题与展望

参考文献

附录

致谢

作者简介