疯草棘豆蠕孢菌吡咯啉5-羧化-还原酶基因敲除菌株的构建

摘要

疯草类植物广泛分布于我国西部草原，动物采食该类植物后会出现头部水平震颤、运动障碍等典型的疯草中毒症状，严重时可导致动物死亡，给我国草原畜牧业造成巨大经济损失。研究表明，疯草类植物的主要毒性成分是苦马豆素(Swainsonine，SW)，而疯草棘豆蠕孢菌（Undifilum oxytropis）是疯草内苦马豆素生物合成的根本原因。目前已知，苦马豆素可由三类真菌产生，即豆类丝核菌（Rhizoctonia leguminicola）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和疯草棘豆蠕孢菌。苦马豆素的生物合成通路在豆类丝核菌和金龟子绿僵菌中研究已较为深入，而有关疯草棘豆蠕孢菌苦马豆素的生物合成通路及调控合成的关键酶尚不清楚。课题组前期采用高通量测序技术对疯草棘豆蠕孢菌进行了全基因组测序，通过基因功能和注释分析并筛选出了可能的参与苦马豆素生物合成的部分关键酶，而吡咯啉-5-羧化还原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)就是其中一个关键的调控酶。
　　鉴于此，本试验以疯草棘豆蠕孢菌为研究对象，利用基因工程技术构建疯草棘豆蠕孢菌的P5CR基因敲除菌株，具体研究结果如下:
　　1.根据疯草棘豆蠕孢菌全基因组测序结果注释的P5CR基因设计引物，以疯草棘豆蠕孢菌cDNA为模板，高保真扩增P5CR基因，PCR产物测序结果与注释的P5CR基因序列BLAST比对同源性为99％。
　　2.以PUC19质粒为载体，构建了含潮霉素抗性基因的疯草棘豆蠕孢菌P5CR基因的敲除载体，P5CR上游目的基因序列和下游目的基因序列分别连在潮霉素抗性基因的两端。经PCR验证、测序和双酶切鉴定，成功构建载体。
　　3.将构建好的载体质粒线性化后，利用REMI转化法将线性化载体转化原生质体，进行疯草棘豆蠕孢菌原生质体P5CR基因的敲除。接着经潮霉素筛选获得转化株，转化株提取DNA，进行PCR验证，结果显示P5CR基因敲除菌株构建成功。
　　本研究成功获得了疯草棘豆蠕孢菌P5CR基因敲除菌株，为后续研究该基因对疯草棘豆蠕孢菌苦马豆素生物合成的影响及不产苦马豆素疯革新品种的培育奠定理论基础。

目录

论文说明

声明

摘要

前言

第一章 疯草及苦马豆素研究进展

1．1 疯草研究概况

1．1．1 疯草的定义及分布

1．1．2 疯草的危害

1．1．3 疯草的防控

1．2 苦马豆素研究概况

1．2．1 苦马豆素的来源

1．2．2 苦马豆素的理化性质

1．2．3 苦马豆素的毒性研究

1．2．4 苦马豆素的应用前景

第二章 疯草棘豆蠕孢菌研究进展

2．1 疯草内生真菌的种类

2．2 疯草棘豆蠕孢菌的生长特性

2．2．1 疯草棘豆蠕孢菌的形态

2．2．2 疯草棘豆蠕孢菌的分布

2．2．3 疯草棘豆蠕孢菌传播方式

2．3 疯草棘豆蠕孢菌与宿主植物

2．4 疯草棘豆蠕孢菌与苦马豆素

2．5 疯草棘豆蠕孢菌合成苦马豆素通路的研究

2．5．1 酵母氨酸的合成

2．5．2 哌可酸的合成

第三章 疯草棘豆蠕孢菌P5CR基因敲除菌株的构建

3．1 试验材料

3．1．1 菌种和质粒

3．1．2 试剂及培养基

3．1．3 培养基与溶液

3．1．4 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 棘豆蠕孢菌P5CR基因的克隆与测序

3．2．2 棘豆蠕孢菌P5CR基因敲除载体的构建

3．2．3 P5CR基因敲除菌株的获得

3．3 试验结果

3．3．1 棘豆蠕孢菌P5CR基因的扩增

3．3．2 棘豆蠕孢菌P5CR基因敲除载体的构建

3．3．3 P5CR基因敲除菌株的获得

3．4 讨论

3．4．1 苦马豆素生物合成通路及关键调控酶

3．4．2 in-Fusion? HD Cloning Kit构建载体

3．4．3 REMI法转化

结论

参考文献

致谢

作者简介