大连紫海胆KLF8、KLF10、KLF13基因的克隆与表达及C/EBPs基因启动子活性研究

摘要

大连紫海胆（Strongylocentrotus nudus）是中国重要的经济水产物种，其性腺富含多种不饱和脂肪酸。然而大连紫海胆性腺脂类物质生成和脂肪酸合成的调控机制至今仍是空白。锌指样转录因子（Krüppel-like factors，KLFs）和CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)已经被证实在脂肪代谢中起调控作用。KLFs基因家族包含17个成员，其中KLF15，KLF4，KLF5，KLF6和KLF9促进脂肪形成，KLF2和KLF3抑制脂肪形成。C/EBPs基因家族包含6个成员(C/EBPα，C/EBPβ，C/EBPγ，C/EBPδ，C/EBPε和C/EBPζ)，其在调控脂肪形成中是一个关键的转录因子。阐明大连紫海胆KLFs基因的功能和C/EBPs基因的转录调控以及KLFs与C/EBPs的互作调控机制，对了解大连紫海胆脂类物质形成机理的研究具有重要的意义。
　　本研究筛选转录组中的脂类物质形成相关基因序列，设计特异性引物、构建过表达载体和逐段缺失载体，结合实时荧光定量PCR技术、Genome Walking技术、双荧光素酶报告基因实验以及生物信息学分析等，获得了大连紫海胆KLF8、KLF10、KLF13全长cDNA和部分C/EBPs基因序列及其5'侧翼序列，分析了它们的序列特征和组织表达分布，并且对它们在脂类物质形成中的功能进行了相关的探索，得到了以下结果:
　　1、SnKLF8cDNA全长为3954bp，包含97bp5'非翻译区(Untranslated Regions，UTR)和2684bp3'UTR，开放阅读框1164bp，编码387个氨基酸。SnKLF10cDNA全长为3526bp，包含138bp5'UTR和1912bp3'UTR，开放阅读框1476bp，编码491个氨基酸。SnKLF13cDNA全长为3756bp，包含422bp5'UTR和2485bp3'UTR，开放阅读框894bp，编码282个氨基酸。结构域预测表明SnKLF8、SnKLF10和SnKLF13碳端都包含一个三联窜的锌指DNA结合结构域。
　　2、获得了部分SnC/EBPs cDNA序列及完整的SnC/EBPs5'侧翼序列。SnC/EBPα5'侧翼序列为1154bp，SnC/EBPγ5'侧翼序列为1494bp，SnC/EBPζ5'侧翼序列为823bp。结构域预测表明SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ碳端都包含一个亮氨酸拉链结构域(Basic-leucine zipper domain,bZIP)。
　　3、SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13和SnC/EBPs mRNA在雄性性腺和雌性性腺的表达量相对较高，并且在两龄和三龄雌雄性腺的mRNA表达存在差异。
　　4、SnKLF8和SnKLF10过表达，检测SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ启动子的荧光活性不同程度的下降，表明SnKLF8和SnKLF10过表达抑制SnC/EBPs转录活性。SnKLF13过表达，检测SnC/EBPα启动子荧光活性升高，SnC/EBPγ和SnC/EBPζ启动子荧光活性下降，表明SnKLF13提高SnC/EBPα转录活性，抑制SnC/EBPγ和SnC/EBPζ转录活性。
　　5、生物信息学预测SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ启动子的转录因子结合位点，进一步表明SnC/EBPs是SnKLFs转录因子潜在的靶基因。
　　6、双荧光素酶报告基因实验表明SnC/EBPα核心启动子位于-204～-16序列之间，SnC/EBPγ包含两个核心启动子位于-1396～-1179序列和-742～-525序列之间，SnC/EBPζ核心启动子位于164～609序列之间。
　　以上实验结果表明，SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13和SnC/EBPs基因参与大连紫海胆性腺脂类物质的形成，并且SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13发挥功能是依靠调控SnC/EBPs转录来实现的。这将为进一步理解KLF8、KLF10、KLF13和C/EBPs基因在无脊椎动物脂类物质形成机制中的功能奠定基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 脂类的研究

1．2．1 脂类生理功能

1．2．2 脂类代谢

1．2．3 大连紫海胆中的脂类物质

1．3 脂类代谢中转录因子的研究

1．3．3 SREBPs

1．4 KLF家族与脂类物质代谢

1．4．1 KLFs概述

1．4．2 LKF家族转录因子的结构特征

1．4．3 KLF家族转录因子的功能

1．5 研究意义和目的

第二章 大连紫海胆KLF8、KLF10和KLF13基因的克隆和表达模式分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 感受态的制备

2．1．3 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

2．1．4 SnKLF8、10、13转录因子片段克隆和序列验证

2．1．5 获得SnKLF8／10／13转录因子全长cDNA

2．1．6 生物信息学分析

2．1．7 实时定量PCR检测SnKLF8／10／1基因的表达差异

2．2 结果和分析

2．2．1 SnKLF8／10／13基因的克隆和序列分析

2．2．2 SnKLF8／10／13蛋白氨基酸序列比对和系统进化树构建

2．2．3 SnKLF8／10／13基因的组织分布表达

2．2．4 SnKLF8／10／13基因在不同发育阶段雌雄性腺的表达差异

2．3 讨论

第三章 大连紫海胆C／EBPs基因克隆和表达模式分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 感受态的制备

3．1．3 总RNA和cDNA第一链的合成

3．1．4 大连紫海胆肌肉组织DNA的提取

3．1．5 SnC／EBPs转录因子第一片段的验证

3．1．6 检测SnC／EBPs 5'序列区域是否存在内含子

3．1．7 克隆SnC／EBPs转录因子启动子序列

3．1．8 生物信息学分析

3．1．9 qRT-PCR检测SnC／EBPs的表达差异

3．2 结果和分析

3．2．1 SnC／EBPα、SnC／EBPγ、SnC／EBPζ转录因子的克隆和序列分析

3．2．2 SnC／EBPα、SnC／EBPγ、SnC／EBPζ转录因子氨基酸序列比对和系统进化树构建

3．2．3 SnC／EBPs的组织分布表达

3．2．4 SnC／EBPs在不同发育阶段雌雄性腺的表达差异

3．3 讨论

第四章 大连紫海胆C／EBPs启动子活性分析及介导KLF8／10／13调控功能的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．4 大连紫海胆肌肉组织DNA的提取

4．1．5 细胞准备

4．1．8 荧光素酶报告基因实验

4．1．9 SnC／EBPα、SnC／EBPγ、SnC／EBPζ 5'侧翼序列转录结合位点的预测

4．2 结果

4．2．2 SnC／EBPγ启动子活性分析

4．2．4 SnKLF8／10／13转录因子与SnC／EBPs 5'侧翼调控区的互作

4．2．5 SnC／EBPs 5'侧翼调控区转录结合位点的预测

4．3 讨论

第五章 结论和创新点

5．1 本研究得到以下结论

5．2 本研究创新点

参考文献

附录

缩略词

致谢

作者简介