CRISPR/Cas9介导gClqR基因缺失对PCV2感染猪组织病变的影响

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜包裹的单链环状DNA病毒，其是引起断奶仔猪衰竭综合征的主要病原。有研究表明，在PCV2感染猪肺泡巨噬细胞内，PCV2 Cap通过与宿主蛋白gC1 qR相互作用，激活PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路，进而显著促进巨噬细胞中的白介素-10(interleukin-10，IL-10)生成。但是gC1qR在PCV2的体内复制及其导致的病理变化有何种作用？目前并不清楚。本试验拟通过构建靶向于猪gC1qR基因的CRISPR/Cas9重组慢病毒系统，将其感染仔猪后获得部分组织gC1qR基因敲除的仔猪，以PCV2感染部分组织gC1qR基因敲除的仔猪，复制PCV2感染猪模型，阐明gC1qR缺失对PCV2体内复制和诱导病理变化的影响。
　　研究取得以下实验结果:
　　1.本试验利用CRISPR/Cas9系统，设计了3个靶向于猪gC1qR基因的gRNA(g113、g229和g246)，分别成功构建了3个重组慢病毒rLenti-113、rLenti-229和rLenti-246，将构建好的慢病毒感染PK-15细胞后，嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞，western blotting检测和测序鉴定，确定在rLenti-113感染的PK-15细胞中成功获得了一株gC1qR基因敲除的PK-15细胞系。
　　2.大量包装rLenti-113和rLenti-Blank后，以109 copies感染7日龄仔猪4周后，通过western blotting和免疫组织化学技术鉴定，成功获得了部分肺脏和肺门淋巴结中gC1qR缺失的仔猪，分别以PCV2感染正常仔猪、空白慢病毒感染仔猪和部分组织缺失gC1qR的仔猪，结果发现在正常仔猪和空白慢病毒感染仔猪中成功复制了PCV2感染模型，而在部分组织缺失gC1qR的仔猪中，肺脏和肺门淋巴结中PCV2感染诱导的病理变化减轻。
　　3.相同剂量的PCV2感染正常仔猪、空白对照仔猪和部分组织缺失gC1qR的仔猪，和空白对照仔猪相比，部分组织缺失gC1qR的仔猪在PCV2感染1周后血清中病毒的拷贝数较低，感染4周后肺门淋巴结中的病毒拷贝数较低，而肺和肝脏中病毒拷贝数的变化不明显;且在部分组织缺失gC1qR仔猪的肺门淋巴结组织中，Cap和Rep的表达降低。
　　综合以上结果，本研究分别设计了3个靶向于猪gC1qR基因的gRNA，并成功构建了相应的CRISPR/Cas9重组慢病毒，将其分别感染PK-15细胞后确定了rLenti-113能介导靶向gC1qR基因并敲除，将rLenti-113感染仔猪后于肺门淋巴结中敲除了gC1qR基因，以PCV2感染部分组织缺失gC1qR的仔猪，发现在缺失gC1qR的相应组织中PCV2的复制水平降低，导致的病理变化有所减轻，此研究初步明确了gC1qR基因在PCV2的复制和致病过程中的作用，为进一步揭示PCV2致病机制提供了理论依据。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 PCV2 Cap蛋白及其相互作用分子研究进展

1．1 PCV2病原学特征

1．2 Cap蛋白分子特征

1．3 Cap蛋白在PCV2病毒复制和致病中的作用

1．3．1 Cap蛋白在PCV2病毒复制中的作用

1．3．2 Cap蛋白在PCV2致病中的作用

1．4 Cap蛋白相互作用的细胞蛋白及其功能

1．4．1 gClqR蛋白及其功能

1．4．2 其他5种相互蛋白及其功能

第二章 CRISPR／Cas9基因编辑技术研究进展

2．1 基因编辑技术概况

2．2 CRISPR／Cas9基因编辑技术原理及研究概况

2．3 本研究的目的和意义

第三章 靶向于猪gClqR基因的CRISPR／Cas9慢病毒系统的构建及鉴定

3．1 试剂材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 载体的构建

3．2．2 慢病毒的包装

3．2．3 相对定量标准曲线的建立

3．2．4 慢病毒滴度的测定

3．2．5 筛选稳定转染的阳性细胞

3．2．6 Western Blotting检测

3．2．7 测序鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 gClqR基因敲除位点的确定

3．3．2 双酶切鉴定

3．3．3 标准曲线及慢病毒滴度测定

3．3．4 慢病毒感染PK-15细胞的筛选

3．3．5 Western blotting检测gClqR基因敲除情况

3．3．6 测序

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 gClqR基因缺失对PCV2感染猪组织病变的影响

4．1 试剂材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要试剂的配制

4．2 方法

4．2．1 动物试验分组

4．2．2 试验动物病原检测

4．2．3 CRISPR／Cas9慢病毒感染构建部分组织gClqR-／-仔猪

4．2．4 PCV2感染猪模型的构建

4．2．5 gClqR缺失对PCV2在机体内复制的影响

4．2．6 石蜡切片的制作

4．2．7 免疫组织化学染色

4．2．8 HE染色

4．3 结果与分析

4．3．1 浓缩慢病毒后拷贝数测定

4．3．2 仔猪病原学检测

4．3．3 慢病毒感染仔猪的体温和体重变化

4．3．4 仔猪组织中gClqR基因敲除鉴定

4．3．5 组织部分缺失gClqR对PCV2复制及所致病理变化的影响

4．4 讨论

4．5 小结

结论与创新点

参考文献

主要缩略词和中英文对照表(Abbreviation Index)

致谢

作者简介