铜胁迫下天蓝苜蓿共生根中差异基因的表达分析及功能鉴定

摘要

重金属胁迫对共生固氮的影响，目前多停留在表型观察及生理数据分析，对其分子机制方面的研究鲜有报道。本研究以豆科植物天蓝苜蓿作为研究对象，对实验室前期通过RNA-seq分离到的铜胁迫下天蓝苜蓿共生根中差异表达的部分基因，分别进行铜胁迫及共生过程的表达分析，检测它们与铜胁迫及共生的关系;同时，利用RNA干扰技术，对前期验证过的一个与铜胁迫相关且在接菌根中特异表达的几丁质酶编码基因Cu33611，进行结瘤过程的功能鉴定。研究内容及得到的结果简述如下:
　　1.编码富含半胱氨酸簇的蛋白质(cysteine cluster protein，CCP)基因被认为与防御和共生相关。选择9个CCP基因进行共生过程的表达分析，9个CCP基因的表达大体上可分为三类:ML68936_c0和ML94029_c0的表达水平在接菌后7d达到或接近最高水平，随后下降，直至接菌后30d恢复高水平表达，主要在结瘤的早期和晚期表达;ML67778_c0、ML85596_c0、ML98221_c0、ML101635_c0和ML68801_c0在根瘤形成中期表达量较高，接菌后30d时达到最高，可能在结瘤中期和晚期起作用;ML54082_c0、ML64613_c0和ML90197_c0则在根瘤形成晚期表达量较高，其他检测时间点不表达或低水平表达，推测其主要在根瘤形成晚期发挥作用。
　　2.与乙烯合成及信号转导相关基因的表达分析显示，乙烯合成有关的基因ML98991_c3(氨基环丙烷羧酸氧化酶，ACO)和ML93355_c1(氨基环丙烷羧酸合成酶，ACS)在根瘤形成不同时期被强烈诱导，铜胁迫下，ML98991_c3主要在结瘤晚期被抑制，而ML93355_c1在接菌后10，30d被抑制;两个乙烯受体基因（ML46877_c0和ML84940_c2）和一个EIN3靶向F盒基因(ML46356_c0)分别在结瘤中后期明显上调，铜胁迫下，ML84940_c2和ML46356_c0在结瘤过程中受到不同程度的诱导，但是ML46877_c0在结瘤晚期被抑制;此外，5个AP2/ERF家族基因ML102013_c0、ML99097_c0、ML99511_c0、ML85546_c0、ML98388_c0在接种后30d的根和根瘤中都有表达，除了ML99097_c0，其余4个基因的表达在共生根及根瘤中被抑制。
　　3.铜离子结合及转运相关基因的表达分析表明，所检测的三个基因ML98423_c0、ML52550_c0和ML98670_c0分别编码Cu转运ATP酶、高亲和性铜转运蛋白及推测的重金属转运/脱毒超家族蛋白成员，在Cu胁迫条件下，ML98670_c0、ML52550_c0表达下调，ML98423_c0表达上调，可能和Cu胁迫条件下维持植物体内的铜离子稳态平衡有关。接菌后这3个基因表达上调，特别是ML52550_c0和ML98670_c0上调明显，表明它们可能参与了根瘤形成的调控。此外，两个吞噬细胞相关基因ML85004_c0、ML89530_c0在根和根瘤中有着不同的表达。
　　4.RNAi结果显示，Cu33611沉默后天蓝苜蓿表现出植株矮小，结瘤数减少，根瘤较小;接菌10d的侵染事件分析表明，和对照相比，干扰后根毛卷曲，侵染线数目以及根瘤原基数目都显著降低;接菌后30d的根瘤石蜡切片显示，干扰后的天蓝苜蓿植株根瘤中的侵染细胞在数目及密集程度上都远低于对照根瘤，侵染区和固氮区的侵染细胞都减少，结瘤明显受到影响。这些结果表明，Cu33611确实参与了结瘤过程的调控，其具体功能还需要进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 豆科植物与根瘤菌之间共生关系的建立

1．1．1 豆科植物和根瘤菌共生互作的分子机制

1．1．2 根瘤的类型

1．1．3 豆科植物结瘤特异性的富含半胱氨酸多肽

1．2 Cu对植物生长及共生固氮的影响

1．2．1 Cu对植物生长的影响

1．2．2 植物的铜胁迫响应

1．2．3 Cu对共生固氮的影响

1．3 几丁质酶在植物胁迫和共生中的作用

1．3．1 几丁质酶与植物的防御反应

1．3．2 几丁质酶在共生中的作用

1．4 选题依据和研究意义

1．5 研究内容及创新点

1．6 技术路线

第二章 CCP类基因的表达分析

2．1 引言

2．2 材料、试剂和仪器

2．3 实验方法

2．3．1 植物样品的种植和样品采取

2．3．2 样品获取和保藏

2．3．4 除去基因组DNA

2．3．5 实时定量PCR引物设计

2．3．6 反应体系和实验程序

2．3．7 引物设计

2．4 结果与分析

2．4．1 样品RNA的检测与纯化

2．4．2 目的基因的qPCR分析

2．5 讨论

第三章 乙烯合成及信号传递相关基因的表达分析

3．1 引言

3．2 材料、试剂和仪器

3．3 试验方法

3．3．1 试验方法

3．3．2 引物设计

3．4 结果与分析

3．5 讨论

第四章 铜离子转运及结合相关基因的表达分析

4．1 引言

4．2 材料、试剂和仪器

4．3 试验方法

4．3．1 试验方法

4．3．2 引物设计

4．4 结果与分析

4．5 讨论

第五章 Cu33611在共生结瘤中的功能鉴定

5．1 引言

5．2 实验材料、试剂和仪器

5．3 实验方法

5．3．1 干扰载体的构建

5．3．2 重组质粒转化农杆菌

5．3．3 天蓝苜蓿的转化体系

5．4 干扰实验结果鉴定

5．4．1 Cu33611干扰目的片段的扩增

5．4．2 Cu33611干扰载体的构建

5．4．3 干扰组培苗的表型观察

5．4．4 干扰效率检测

5．4．5 Cu33611RNAi转化苗生长和结瘤分析

5．4．6 根瘤显微结构观察

5．4．6 根瘤显微结构观察

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介