冷鲜肉中细菌生物膜的形成及其清除特性研究

摘要

冷鲜肉作为目前主要的并且市场占有率呈递增趋势的猪肉销售方式，其肉品生产加工链中潮湿且富含营养的表面为微生物繁殖和生物膜的形成提供了良好的环境。相比不具有生物膜形成能力的细菌，具有生物膜形成能力的细菌通常可以更牢固的粘附于不锈钢、玻璃材质的设备和器具表面，难以清除从而引发食品污染的安全隐患。
　　本文主要研究市售冷鲜肉中混合菌群的成膜特性，以冷鲜肉淋洗液为培养基质，探究不同材质、温度、培养时间影响下的细菌生物膜形成情况。从培养成熟的细菌生物膜中分离出成膜能力较强的细菌，并采用16s RNA测序比对方法鉴定细菌种类。采用次氯酸钠清洗剂结合超声波清除细菌生物膜，模拟工业生产冷鲜肉的低温条件下对有害的细菌生物膜的清除，效果显著。主要研究结果如下:
　　(1)对采集自超市冷柜的冷鲜肉细菌总数进行测定结果为2.6×105cfu/g，低于国标。以冷鲜肉淋洗液为培养基质，原有的混合菌群为实验对象，进行生物被膜形成研究。培养时间对生物膜的形成具有显著影响，在4℃下，生物被膜的生成量逐渐增加第6天时达到峰值，显著地高于其它培养时间。在混合菌液的接触面类型玻璃与不锈钢片表面，生物膜的形成量没有明显差异。温度对生物膜的形成具有显著影响，4℃下培养6天最佳的生物膜形成量与26℃下无显著差异，但显著高于15℃条件下的生物膜形成量。
　　(2)从成熟生物膜中分离纯化出细菌菌株.从200余株疑似具有单独成膜能力的细菌菌株中，筛选出具有强成膜能力的九株细菌，其相对成膜能力SBF均大于1。通过16SRNA序列比对，结果显示为其中有一株假单胞菌，一株成团泛菌，两株变形杆菌，五株腐败希瓦氏菌。
　　(3)化学清洗剂次氯酸钠溶液以及超声波清除处理对玻璃试管内壁形成的生物被膜的生物活性均具有极显著的清除灭活作用，清除效果明显。超声波单独作用时对玻璃表面和不锈钢表面生物被膜的清除效率分别是60％与50％。次氯酸钠溶液对生物被膜的清除效果均达到90％以上，且浓度为200ppm、400ppm、600ppm之间的清除率无明显差异。单独的次氯酸钠溶液的清除效果极显著优于超声波的清除效果。对于不同材质玻璃和不锈钢片，两种材质各处理组的清除效果无显著差异。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 冷鲜肉的发展现状

1．1．1 冷鲜肉的概况

1．1．2 冷鲜肉的加工流程

1．1．3 冷鲜肉加工流通过程中的污染途径

1．1．4 冷鲜肉的微生物污染现状

1．2 细菌生物膜概述

1．2．1 细菌生物膜定义及特点

1．2．2 细菌生物膜对食品安全和卫生的隐患

1．3 细菌生物膜的清除

1．4 细菌的鉴定

1．4．1 PCR技术

1．4．2 16S RNA测序技术

1．5 研究目的意义

1．6 主要研究内容

1．7 研究技术路线

第二章 冷鲜肉中细菌成膜特性研究

2．1 前言

2．2 材料与仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要仪器

2．2．3 实验材料

2．3 实验方法

2．3．1 样品采集及预处理

2．3．2 细菌生物膜的形成

2．3．3 不同条件下形成的细菌生物膜测定

2．3．4 数据处理及分析

2．4 结果与分析

2．4．1 肉样初始细菌浓度

2．4．2 培养时间对冷鲜肉中微生物成膜特性的影响

2．4．3 材质对冷鲜肉中微生物成膜特性的影响

2．4．4 温度对冷鲜肉中微生物成膜特性的影响

2．5 讨论

2．6 本章小结

第三章 细菌生物膜形成细菌的分离鉴定

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验试剂

3．2．2 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 细菌的分离

3．3．2 细菌生物膜形成能力测定

3．3．3 PCR反应

3．3．4 16SRNA测序

3．3．5 数据处理与分析

3．4 结果与分析

3．4．1 细菌菌株的相对成膜能力测定

3．4．2 凝胶电泳结果

3．4．3 细菌鉴定结果

3．5 讨论

3．6 本章小结

第四章 细菌生物膜的清除研究

4．1 前言

4．2 材料与仪器

4．2．1 仪器与设备

4．2．2 试剂

4．3 实验方法

4．3．1 实验预处理

4．3．2 细菌生物膜的形成

4．3．3 细菌生物膜的清除

4．3．4 扫描电镜观察清除情况

4．3．5 数据处理与分析

4．4 实验结果

4．4．1 平板计数结果

4．4．2 结晶紫染色法结果

4．4．3 扫描电镜观察不同清除方法对细菌生物膜的影响

4．5 讨论

4．6 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

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