外泌体miRNA和lncRNA作为奶牛乳腺炎分子标记的筛选和功能鉴定

摘要

乳腺炎是危害奶牛养殖业的一种常见病和多发病，不仅造成巨大的经济损失，还会对奶牛和人类造成严重的危害、危及奶牛以及人类的健康。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。在金黄色葡萄球菌感染前后，牛奶外泌体中的miRNA和lncRNA发生了巨大的变化，有望作为鉴定乳腺炎发病的分子标记。本文主要对牛奶外泌体在金黄色葡萄球菌感染前后，miRNA和lncRNA的表达情况进行研究，得到如下结果：
　　1.通过二代测序，对3个正常牛奶外泌体组和6个金黄色葡萄球菌感染的牛奶外泌体组中miRNA进行对比分析。得到原始测序总读数达到101,392,712，平均每个样本读数11,265,856。去除污染序列后，得到的总clean data读数为94,187,107，平均每个样本读数10,465,234。共鉴定出372个新的miRNA。在金黄色葡萄球菌感染前后，共鉴定出37个miRNA有差异表达，其中22个为已知的miRNA，15个为新的miRNA。如bta-miR-1在金黄色葡萄球菌感染组中上调了3.79倍，bta-miR-122在金黄色葡萄球菌感染组中上调了16.4倍。通过生物信息学的预测，22个已知的miRNA对应着10577个靶基因。GO和KEGG注释表明差异表达的miRNA参与细胞的生理过程和炎症反应。
　　2.通过二代测序，对3个正常牛奶外泌体组和6个金黄色葡萄球菌感染的牛奶外泌体组中lncRNA进行研究。原始测序总读数达到874,840,266，平均每个样本读数约97,204,474。去除污染序列后，得到的总clean data读数为845,687,262，平均每个样本读数约93,965,251。通过CNCI、CPC、CPAT和hmmscan4种软件，本研究鉴定到500个lncRNA。在金黄色葡萄球菌感染前后，9个lncRNA有差异表达，其中4个lncRNA上调表达，5个lncRNA下调表达。
　　3.发现金黄色葡萄球菌在入侵乳腺上皮细胞30 min、1 h、2 h、6 h和12 h时， bta-miR-21-3p的表达量升高。通过双荧光素酶的实验和Western blot技术，鉴定出bta-miR-21-3p的靶基因是IL-25，IL-25可以诱导炎症因子的表达和Th2型细胞因子反应。该结果解释了金黄色葡萄球菌感染的早期，促炎细胞因子没有显著表达的现象。
　　4.利用生物信息学分析，对5个乳腺上皮细胞的数据集进行基因间lncRNA的预测，通过CNCI、CPC、CPAT和hmmscan4种软件，共鉴定到了184个基因间lncRNA。发现了113个基因间lncRNA位于399个QTL位点上，其中一个基因间lncRNA位于乳腺炎QTL位点上，36个基因间lncRNA位于牛奶相关的QTL位点上。
　　5.为了探索在中国西北地区牛奶来源的葡萄球菌属中，是否存在精氨酸分解代谢元件，对牛奶中的葡萄球菌进行分离，分离得到146株葡萄球菌。其中溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）34株、金黄色葡萄球菌（S. aureus）37株、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）24株、产色葡萄球菌（S. chromogenes）19株、沃氏葡萄球菌（S. warneri）30株。我们对其中一株表皮葡萄球菌Y24中SCCmec的分析发现含有精氨酸分解代谢元件，这是首次在中国西北地区发现家畜来源的葡萄球菌中含有精氨酸分解代谢元件；其表现出多种耐药和抗重金属的特性，这些特性可能随着SCCmec的转移而传播，也可以传播到人相关葡萄球菌，进而导致严重的耐药菌株的产生。
　　综上所述，本研究比较了正常牛奶中和乳腺炎牛奶中外泌体差异miRNA和lncRNA的表达情况，鉴定到的差异表达miRNA和lncRNA，既能扩展我们对于奶牛miRNA和lncRNA图谱的认识，又能帮助人们了解miRNA和lncRNA在基因组上的功能，还能作为乳腺炎的分子标记。此外，本研究初次在中国西北地区发现家畜来源的葡萄球菌中含有精氨酸分解代谢元件。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能和外泌体的分泌

1.2 奶牛乳腺炎的主要病原菌

1.3 葡萄球菌SCCmec分型及传播机制

1.4 非编码RNA的生物学特征

1.5 奶牛miRNA和lncRNA的研究进展

1.6 本研究的目的和意义

第二章 正常牛奶和乳腺炎牛奶中外泌体miRNA测序及差异分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 正常牛奶和乳腺炎牛奶中外泌体lncRNA测序及差异分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 乳腺炎相关bta-miR-21-3p靶基因鉴定和功能研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 乳腺上皮细胞基因间lncRNA分析

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 奶牛乳腺炎葡萄球菌精氨酸分解代谢移动元件研究

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果

6.4 讨论

6.5 小结

第七章 论文总结

7.1 研究结论

7.2 创新点

7.3 进一步研究的思路

参考文献

附录

附录1 培养基和主要试剂的配置方法

附录2 细菌基因组的提取

附录3 总RNA的提取

附录4 被鉴定出的新的miRNA

附录5 基因间lncRNA在牛奶和乳腺炎相关QTL的定位

附录6 质粒提取

附录7 DNA片段回收

附录8 大肠杆菌感受态DH5a的制备和转化

附录9 Western Blot检测蛋白表达水平

致谢

作者简介